Potato virus A as a heterologous protein expression tool in plants

Viruksien käyttö tuotekehityksen ja tutkimuksen vaatimien proteiinien tuottamiseen, syötävien rokotteiden kehittämiseen ja geeniterapiaan edustavat kasvavia biotekniikan sovellusalueita. Perunan A-virus (PVA) kuuluu potyviruksiin, joiden proteiinit tuotetaan aluksi yhtenä suurena molekyylinä, joka pilkotaan yksittäisiksi proteiineiksi viruksen itsensä tuottamilla entsyymeillä. Siten virusgenomiin lisätty vieras geeni käännetään proteiiniksi virusproteiinien mukana. Lopputuloksena kaikkia proteiineja tuotetaan kasvisoluissa samansuuruinen määrä. Lisäksi, viruksen proteiinikuoren koontimekanismi sallii perintöaineksen merkittävän lisäyksen ilman että viruksen tartutuskyky merkittävästi heikkenee. Koska virus monistuu ja leviää koko kasviin, jo melko pieni määrä kasveja riittää huomattavan proteiinimäärän tuottamiseen esimerkiksi säännösten mukaisessa kasvihuoneessa. Tämän työn tarkoituksena oli muuntaa PVA:n genomia siten, että virus soveltuisi yhden vieraan proteiinin tai useiden erilaisten proteiinien samanaikaiseen tuottamiseen kasveissa. Aluksi kokeiltiin viruksen replikaasia ja kuoriproteiinia koodaavien genomialueiden välistä kohtaa ja ihmisestä peräisi olevaa geeniä, joka tuotti S-COMT-entsyymiä (katekoli-O-metyylitransferaasi). Sen aktiivisuuden rajoittaminen auttaa Parkinsonintaudin hoidossa. Kasvissa tuotettua S-COMT:ia voitaisiin käyttää lääkekehityksessä estolääkkeiden testaukseen. Kahden viikon kuluttua tartutuksesta tupakan lehdissä oli entsymaattisesti aktiivista S-COMT:ia n. 1 % lehden liukoisista proteiineista. PVA:n P1-proteiinia koodaavalta alueelta oli paikannettu kohta, johon ehkä voitaisiin siirtää vieras geeni. Asia varmistettiin siirtämällä tähän kohtaan meduusan geeni, joka tuottaa UV-valossa vihreänä fluoresoivaa proteiinia (GFP). GFP-geeniä kantava PVA levisi kasvissa ja lisääntyi n. 30-50 %:iin viruksen normaalista pitoisuudesta. Koko kasvi fluoresoi vihreänä UV-valossa. Vieras geeni voidaan sijoittaa myös potyviruksen P1- ja HCpro-proteiineja koodaavien alueiden väliin. Samaan PVA-genomiin siirrettiin kolme geeniä, yksi kuhunkin kolmesta kloonauskohdasta: GFP-geeni P1:n sisälle, merivuokon lusiferaasigeeni P1/HCpro-kohtaan ja bakteerin beta-glukuronidaasigeeni (GUS) replikaasi/kuoriproteiini-kohtaan. Virusgenomin ja itse viruksen pituudet kasvoivat 38 %, mutta virus säilytti tartutuskykynsä. Se levisi kasveissa saavuttaen n. 15 % viruksen normaalista pitoisuudesta. Kaikki kolme vierasta proteiinia esiintyivät lehdissä aktiivisina.

An infectious clone of Potato virus A (PVA) (genus Potyvirus, family Potyviridae) was engineered to be used as an expression vector for production of heterologous proteins. The PVA genome (9565 nt) is translated to a large polyprotein that is subsequently processed to up to ten mature proteins. Hence, a foreign sequence inserted into an infectious cDNA clone of PVA will also be translated as part of the viral polyprotein in infected plants. Three sites in the genome of PVA were used for expression of heterologous protein encoding sequences in plants. Proteolytic cleavage sites for the viral proteinases were engineered and added for separation of the heterologous protein from the viral proteins. A novel genomic location for foreign encoding sequence expression was tested by inserting the Aequorea victoria gfp sequence encoding the green fluorescent protein (GFP) into the P1 encoding region. The vector-PVA expressing GFP accumulated to about 30-50 % of the levels reached with the wild-type PVA in Nicotiana benthamiana cells at 14 days post-inoculation. The vector-PVA continued to produce intact GFP in the systemically infected plants for 3 weeks post-inoculation. The cloning site between the polymerase (NIb) and CP encoding regions of PVA was tested for expression of human proteins. Soluble catechol-O-methyltransferase (S-COMT) that is involved in development of Parkinson’s disease, was produced from the vector PVA and constituted ca. 1% of the total soluble proteins in systemically infected N. benthamiana leaves. The third cloning site that can be used in PVA is between the P1 and HC-Pro encoding regions. Subsequently, all the three cloning sites were combined in the same vector-PVA clone to simultaneously produce three heterologous proteins: GFP from the P1 site, luciferase from the P1/HC-Pro site, and ß-glucuronidase from the NIb/CP site. Vector-virus amounts in the systemically infected leaves of N. benthamiana were 15 % of those of the wild-type virus at 14 days post-inoculation. All three heterologous proteins were detected in the leaf sap in an active form. In conclusion, PVA can be used for simultaneous production of at least three proteins (together consisting of over 1000 amino acid residues) in plants, which possibly will be useful for some research purposes and for heterologous protein production.