Genomic and functional profiling of gastric cancer

Helicobacter pylori infection is a risk factor for gastric cancer, which is a major health issue worldwide. Gastric cancer has a poor prognosis due to the unnoticeable progression of the disease and surgery is the only available treatment in gastric cancer. Therefore, gastric cancer patients would greatly benefit from identifying biomarker genes that would improve diagnostic and prognostic prediction and provide targets for molecular therapies. DNA copy number amplifications are the hallmarks of cancers in various anatomical locations. Mechanisms of amplification predict that DNA double-strand breaks occur at the margins of the amplified region. The first objective of this thesis was to identify the genes that were differentially expressed in H. pylori infection as well as the transcription factors and signal transduction pathways that were associated with the gene expression changes. The second objective was to identify putative biomarker genes in gastric cancer with correlated expression and copy number, and the last objective was to characterize cancers based on DNA copy number amplifications. DNA microarrays, an in vitro model and real-time polymerase chain reaction were used to measure gene expression changes in H. pylori infected AGS cells. In order to identify the transcription factors and signal transduction pathways that were activated after H. pylori infection, gene expression profiling data from the H. pylori experiments and a bioinformatics approach accompanied by experimental validation were used. Genome-wide expression and copy number microarray analysis of clinical gastric cancer samples and immunohistochemistry on tissue microarray were used to identify putative gastric cancer genes. Data mining and machine learning techniques were applied to study amplifications in a cross-section of cancers. FOS and various stress response genes were regulated by H. pylori infection. H. pylori regulated genes were enriched in the chromosomal regions that are frequently changed in gastric cancer, suggesting that molecular pathways of gastric cancer and premalignant H. pylori infection that induces gastritis are interconnected. 16 transcription factors were identified as being associated with H. pylori infection induced changes in gene expression. NF-κB transcription factor and p50 and p65 subunits were verified using elecrophoretic mobility shift assays. ERBB2 and other genes located in 17q12- q21 were found to be up-regulated in association with copy number amplification in gastric cancer. Cancers with similar cell type and origin clustered together based on the genomic localization of the amplifications. Cancer genes and large genes were co-localized with amplified regions and fragile sites, telomeres, centromeres and light chromosome bands were enriched at the amplification boundaries. H. pylori activated transcription factors and signal transduction pathways function in cellular mechanisms that might be capable of promoting carcinogenesis of the stomach. Intestinal and diffuse type gastric cancers showed distinct molecular genetic profiles. Integration of gene expression and copy number microarray data allowed the identification of genes that might be involved in gastric carcinogenesis and have clinical relevance. Gene amplifications were demonstrated to be non-random genomic instabilities. Cell lineage, properties of precursor stem cells, tissue microenvironment and genomic map localization of specific oncogenes define the site specificity of DNA amplifications, whereas labile genomic features define the structures of amplicons. These conclusions suggest that the definition of genomic changes in cancer is based on the interplay between the cancer cell and the tumor microenvironment.

Mahasyöpä on maailmanlaajuinen ongelma ja noin miljoona potilasta sairastuu mahasyöpään vuosittain. Helicobacter pylori infektio on keskeisin mahasyövän riskitekijä. Mahasyövässä on kaksi alatyyppi, intestinaalinen ja diffuusi, joilla on erilaiset biologiset ja kliiniset ominaisuudet. Mahasyövän korkea kuolleisuus johtuu siitä, että tautia ei diagnosoida ajoissa ja usein diagnoosivaiheen syöpä on pitkälle edennyt adenokarsinooma, johon eivät hoidot enää tehoa. Tästä johtuen mahasyöpäpotilaat hyötyisivät merkittävästi uusista molekylaarisista biomarkkereista, joita voitaisiin käyttää taudin todentamiseen, ennusteen määrittämiseen sekä kohdennettujen hoitojen kehittämisessä. DNA:n kopiolukumuutokset, monistumat ja häviämät, ovat keskeisiä tapahtumia syöpägeenien toiminnan aktivoinnissa ja syövän kehityksessä. Geenien kopioluvulla on yhteys niiden toimintaan ja monistumat lisäävät onkogeenien ilmentymistä ja häviämät estävät kasvaimenestogeenien toimintaa. Tutkimuksen tavoitteina oli 1) määritellä H. pylori infektion kohdegeenit ja geenien säätelyverkostot, 2) tunnistaa kliinisesti merkittäviä mahasyöpägeenejä sekä 3) kuvata DNA kopiolukumonistumien biologisia ja mekanistisia taustoja. H. pylori infektion kohdegeenejä tutkittiin in vitro mallin avulla, jossa AGS mahasyöpäsoluja stimuloitiin bakteereilla. Bakteeri-infektion aikasarjanäytteiden geeni-ilmentyminen profiloitiin DNA mikrosirujen avulla. DNA mikrosirut mahdollistavat tuhansien geenien samanaikaisen mittaamisen. Tutkimuksessa tunnistettiin 200 geeniä, joiden ilmentyminen muuttui koejärjestelyn aikana. Näistä 10 geenin muutokset varmistettiin kvantitatiivisellä PCR menetelmällä. H. pylori infektion ensisijainen kohdegeeni oli FOS, jonka ilmentyminen lisääntyi huomattavasti jo 30 minuutin bakteeristimulaation jälkeen. Lisäksi H. pylori infektio sääteli useiden stressivasteessa toimivien geenien aktiivisuutta. Tilastollinen analyysi paljasti, että H. pylori infektion vastegeenit sijaitsivat genomialueilla, joissa havaitaan useasti muutoksia mahasyövässä. H. pylori infektion kohdegeenejä luetaan kroonisen, vuosikymmeniä kestävän tartunnan aikana paljon. Geeniluenta avaa geenien pakkauksen ja altistaa ne DNA vaurioille ja aktiivisesti luetuille geenialueille syntyy DNA vaurioita todennäköisemmin kuin hiljaisille alueille. H. pylori pysyy infektoimansa solun pinnalla eikä mene solun sisään, joten isäntäsolun reaktio H. pylori bakteeri-infektioon välittyy signaalinvälitysreittien kautta. H. pylori infektion aktivoimia signalointitapahtumia solussa tutkittiin aikaisemman DNA mikrosirututkimuksen geeni-ilmentymisprofiilia ja bioinformatiikkamenetelmiä hyödyntäen. H. pylori infektion soluvastetta säätelevien geenien promoottorialueet haettiin Ensembl tietokannasta. Promoottori on geenin luentaa säätelevä DNA alue. Transkriptiotekijät ovat proteiineja, jotka toimivat geenien säätelyssä ja niiden sitoutumiskohdat kartoitettiin H. pylori vastegeenien promoottorialueilla. Kartoitusta tehostettiin vertailemalla ihmisen ja hiiren vastaavien geenien promoottorialueiden konservoitumista. Evoluutiossa konservoituneet kohdat promoottorissa ovat todennäköisesti toiminnallisia ja osallistuvat geenin säätelyyn. H. pylori infektion vasteen säätelyyn osallistuvat transkriptiotekijät määriteltiin vertailemalla niiden esiintymismääriä H. pylori infektion kohdegeenien promoottereissa ja satunnaisesti valitussa geenijoukossa. Esiintymiskeskiarvojen eron merkitystä tutkittiin tilastollisilla menetelmillä. Tutkimuksessa tunnistettiin 16 transkriptiotekijää, joiden sitoutumiskohdat olivat rikastuneet H. pylori infektion vastegeeneissä. NF-κB transkriptiotekijän sekä sen alayksiköiden p50 ja p65 aktivoituminen H. pylori infektion seurauksena varmistettiin EMSA menetelmällä. EMSA:lla mitataan tumaan siirtyvien transkriptiotekijöiden määrää käyttämällä transkriptiotekijän sitoutumiskohdan radioaktiivisesti leimattua DNA sekvenssiä sekä transkriptiotekijäproteiinin tunnistavaa vasta-ainetta. H. pylori infektion seurauksena aktivoituvien transkriptiotekijöiden sääteleviä signaalinvälitysreittejä kartoitettiin Biocarta tietokannasta haettujen reittitietojen avulla. H. pylori infektiossa amktivoituneet transkriptiotekijät ja signaalinvälitysreitit liittyvät syövän synnyn kannalta keskeisten toimintojen, mm. solunjakautumisen ja ohjelmoidun solukuoleman, säätelyyn. Kliinisesti merkittäviä kohdegeenejä tutkittiin kattavaa potilasaineistoa hyödyntäen. Tutkimukseen valittiin 38 potilasnäytettä (25 intestinaalisen ja 13 diffuusin tyypin näytettä) kliinisten tietojen ja näytteiden laadun perusteella. Näytteistä eristettiin sekä DNA että RNA ja geenien kopioluku ja ilmentyminen määriteltiin genominlaajuisia DNA mirkosirumenetelmiä hyödyntäen. Mahasyövän alatyypit luokiteltiin geenikopiolukumuutosten perusteella. Intestinal tyypin syöpiin liittyi ERBB2 geenin monistuma sekä 20q ja Xp kromosomialueiden kopioluvun lisääntyminen. Mahasyövän kohdegeenit määriteltiin yhdistämällä geenien kopioluvun ja ilmentymisen DNA mikrosirumittaustulokset. Geenit, joiden ilmentyminen on lisääntynyt kopiolukumonistuman seurauksena tai vähentynyt kopioluvun vähentymisen takia, tunnistettiin tilastollisilla menetelmillä. Tunnistimme125 mahasyövän kohdegeeniä. Keskeiset mahasyövän kohdegeenit, mm. ERBB2, sijaitsivat 17q12-q21 kromosomialueella. ERBB2 ja MUC1 proteiinien ilmentyminen varmistettiin kudosmikrosirua ja immunohistokemiaa käyttäen. Kudossiru on mikroskooppilasi, jolle on kiinnitetty useita kudosnäytteitä. Tutkimuksessa käytetty kudossiru sisälsi 78 mahasyöpänäytettä. Immunohistokemia-menetelmässä kudossirun mahasyöpänäytteet värjättiin vasta-aineilla. DNA kopiolukumonistumien biologisia ja mekanistisia taustoja tutkittiin kansainvälisistä julkaisuista kerätyn tiedon perusteella muodostetun tietokannan avulla. Tietokantaan oli koottu 95 eri syöpätyypin monistumat 893 tutkimuksesta, joissa oli käytetty vertailevaa genomista hybridisaatiota. Tietokannassa oli 4500 tapausta ja mittausten herkkyys oli kromosomijuovatasoa (n=393). Tutkimuksessa käytettiin tilastollisia koneoppimis-, todennäköisyysmallinnus- ja tiedonlouhintamenetelmiä. Tulokset osoittivat, että syntyhistorialtaan ja solutyypiltään samankaltaiset syövät muistuttivat monistumaprofiileiltaan toisiaan ja monistuma-alueet sijaitsevat yhtenevästi tunnettujen onkogeenien kanssa. Lisäksi tiedonlouhintaa sekä tietokoneavusteista mallinnusta hyödyntäen osoitettiin, että monistuma-alueiden reunoille on rikastunut fragiilikohtia, sentromeerejä, telomeerejä sekä geenirikkaita vaaleita kromosomijuovia. Nämä genomiatribuutit liittyvät oletettavasti monistuman syntymekanismiin ja ovat genomin heikkoja kohtia, jotka ovat alttiita DNA vaurioille. H. pylori infektion molekyylikohteet liittyvät soluprosesseihin, jotka voivat edistää syöpään johtavien muutosten syntyä. H. pylori infektion molekyylikohteet saattavat olla hyödyllisiä infektion ennusteen määrittelyssä sekä uusien syöpähoitojen kehittämisessä. Mahasyövän intestinaalinen ja diffuusi alatyyppi olivat molekyyliprofiileiltaan erilaisia ja tunnistetut kohdegeenit voivat olla biologisesti sekä kliinisesti merkittäviä.Tulevaisuudessa H. pylori infektion ja mahasyövän kohdegeenit tulee varmistaa muilla menetelmillä laajemmassa näyteaineistossa. DNA monistumat eivät olleet satunnaisia vaan liittyivät tiettyihin syöpätyyppeihin. Monistumien kohdespesifisyys määrittyi syöpäsolutyypin ja syövä biologisen taustan perusteella. Monistumien rakenne määrittyi genomin vaurioherkkien kohtien mukaan. Syöpien luokittelu molekyyliominaisuuksien ja geneettisten taustojen perusteella parantaa syövän hoidon kehittymistä.