Regulation of tumor suppressor protein p53 in cellular stress and tumorigenesis

Functional loss of tumor suppressor protein p53 is a common feature in diverse human cancers. The ability of this protein to sense cellular damage and halt the progression of the cell cycle or direct the cells to apoptosis is essential in preventing tumorigenesis. Tumors having wild-type p53 also respond better to current chemotherapies. The loss of p53 function may arise from TP53 mutations or dysregulation of factors controlling its levels and activity. Probably the most significant inhibitor of p53 function is Mdm2, a protein mediating its degradation and inactivation. Clearly, the maintenance of a strictly controlled p53-Mdm2 route is of great importance in preventing neoplastic transformation. Moreover, impairing Mdm2 function could be a nongenotoxic way to increase p53 levels and activity. Understanding the precise molecular mechanisms behind p53-Mdm2 relationship is thus essential from a therapeutic point of view. The aim of this thesis study was to discover factors affecting the negative regulation of p53 by Mdm2, causing activation of p53 in stressed cells. As a model of cellular damage, we used UVC radiation, inducing a complex cellular stress pathway. Exposure to UVC, as well as to several chemotherapeutic drugs, causes robust transcriptional stress in the cells and leads to activation of p53. By using this model of cellular stress, our goal was to understand how and by which proteins p53 is regulated. Furthermore, we wanted to address whether these pathways affecting p53 function could be altered in human cancers. In the study, two different p53 pathway proteins, nucleophosmin (NPM) and promyelocytic leukemia protein (PML), were found to participate in the p53 stress response following UV stress. Subcellular translocations of these proteins were discovered rapidly after exposure to UV. The alterations in the cellular localizations were connected to transient interactions with p53 and Mdm2, implicating their significance in the regulation of p53 stress response. NPM was shown to control Mdm2-p53 interface and mediate p53 stabilization by blocking the ability of Mdm2 to promote p53 degradation. Furthermore, NPM mediated p53 stabilization upon viral insult. We further detected a connection between cellular pathways of NPM and PML, as PML was found to associate with NPM in UV-radiated cells. The observed temporal UV-induced interactions strongly imply existence of a multiprotein complex participating in the p53 response. In addition, PML controlled the UV response of NPM, its localization and complex formation with chromatin associated factors. The relevance of the UV-promoted interactions was demonstrated in studies in a human leukemia cell line, being under abnormal transcriptional repression due to expression of oncogenic PML-RARa fusion protein. Reversing the leukemic phenotype with a therapeutically significant drug was associated with similar complex formation between p53 and its partners as following UV. In conclusion, this thesis study identifies novel p53 pathway interactions associated with the recovery from UV-promoted as well as oncogenic transcriptional repression.

Noin joka neljäs suomalainen sairastuu elämänsä aikana syöpään. Syövän syntyyn vaikuttavat sekä perinnölliset seikat että altistuminen elintapojemme ja -ympäristön vaikutuksesta monenlaisille haitallisille tekijöille. Nämä haitalliset tekijät, kuten auringon UV-säteily, voivat aiheuttaa perimäainekseemme, DNA:han, mutaatioita. Soluissa olevat korjausmekanismit huolehtivat useimmiten näiden vaurioiden korjauksesta. Joskus kuitenkin nämä solun korjausmekanismit pettävät ja perimäainekseemme jää DNA-vaurioita solun jakautuessa. Kun nämä vauriot muuttuvat pysyviksi mutaatioiksi ne voivat pahimmassa tapauksessa johtaa syövän syntyyn, jos ne sijaitsevat esimerkiksi solun jakautumista kontrolloivissa geeneissä. Syövän kehitys on kuitenkin pitkän ajan prosessi ja se vaatii useita mutaatioita syntyäkseen. Yksi keskeisimmistä syövän synnyltä suojaavista tekijöistä soluissamme on kasvunrajoiteproteiini p53. p53:n merkityksestä syövän ehkäisyssä kertoo osaltaan se että sen toiminta on estynyt yli 50 %:ssa syövistä. p53-geenin tuottaman proteiinin syövältä suojaava vaikutus perustuu sen kykyyn aktivoitua monissa solun stressitilanteissa ja avustaa virheiden korjauksessa. p53 voi pysäyttää solusyklin etenemisen ja antaa korjausmekanismeille aikaa poistaa perimäaineksen vauriot, jotteivat ne siirry myöhemmin solun jakautuessa tytärsoluihin. p53 itse myös osallistuu näihin korjaustapahtumiin. Jos solussa olevat vauriot ovat liian suuret korjattavaksi, voi p53 aiheuttaa ohjelmoidun solukuoleman, apoptoosin, haitallisten solujen poistamiseksi. p53:n aktiivisuutta soluissa säätelee sen hajotukseen osallistuva proteiini, Mdm2. Vaikka p53:n aktivoitumista solun stressitilanteessa on tutkittu jo vuosia, ei kaikkia siihen osallistuvia tekijöitä ja yksityiskohtia tunneta vielä tarkoin. Useimmat nykyisin käytössä olevat syövän kemoterapeuttiset hoidot johtavat toiminnalliseen p53:een ja hoitojen vaste on usein myös riippuvaista p53:n toimintakyvystä. Koska p53:n merkitys syöpähoitojen ja syövän hoidon vasteen kannalta on siis huomattava, on tärkeää tuntea sen aktivoitumiseen johtavat tapahtumat yksityiskohtaisesti. Tämän tutkimuksen tavoitteena on ollut selvittää tapahtumia, jotka saavat aikaan p53 vasteen UV-säteilytyksen seurauksena. UV-säteilytyksellä tiedetään olevan samankaltaisia vaikutuksia solujen toimintoihin kuin monilla kemoterapeuttisilla aineilla. Tavoitteena on ollut löytää p53:n aktiivisuuteen vaikuttavia proteiineja DNA-vaurion seuraksena. Tutkimuksessa on löydetty kaksi uutta p53:een ja sen negatiiviseen säätelijään, Mdm2:een sitoutuvaa proteiinia. Näiden proteiinien, Promyelosyyttisen leukemia proteiinin (PML) ja nukleofosmiinin (NPM) havaittiin sitoutuvan sekä toisiinsa että p53:een ja Mdm2:een nopeasti UV-säteilytetyissä soluissa. Nämä havaitut proteiinikompleksit todennäköisesti osallistuvat p53:n välittämään stressivasteeseen solujen vaurioiden poistamiseksi. Lisäksi havaittiin interaktioiden liittyvän solun sisäisiin lokalisaatioiden muutoksiin, joilla voi myös olla olennainen merkitys p53:n stressivasteen kannalta. Tutkimuksessa tarkasteltiin myös samojen proteiinien toimintaa eräässä leukemiatyypin solulinjassa. Kyseisessä solulinjassa PML geeni on yhdistynyt solujen erilaistumiseen vaikuttavaan RARα geeniin muodostaen fuusioproteiinin, joka estää PML:n ja RARα:n geenituotteiden normaalin toiminnan ja aiheuttaa leukemian kehittymisen. Tämän fuusioproteiinin havaittiin muuttavan NPM-proteiinin sijaintia solun tumajyväsistä tuman nukleoplasmaan, häiriten todennäköisesti sen normaaleja toimintoja solussa. Lisäksi näiden solujen käsittely terapeuttisesti merkittävällä aineella, retinoihapolla (RA), joka johtaa leukemiasolujen fenotyypin normalisoitumiseen, sai aikaan vastaavan proteiinikompleksin muodostumisen kuin UV-vauriosta palautuvissa soluissa. RA-käsittely johti myös p53:n aktivoitumiseen. Tutkimus antaa uuttaa tietoja kasvunrajoiteproteiini p53:n toimintaan vaikuttavista tekijöistä solujen UV-vaurion jälkeen. Lisäksi tutkimus antaa mekanistista tietoa retinoihapon vaikutuksesta tutkitun leukemiatyypin soluissa.