Molecular genetic studies on nemaline myopathy and related disorders

Nemaline myopathy (NM) is a rare muscle disorder characterised by muscle weakness and nemaline bodies in striated muscle tissue. Nemaline bodies are derived from sarcomeric Z discs and may be detected by light microscopy. The disease can be divided into six subclasses varying from very severe, in some cases lethal forms to milder forms. NM is usually the consequence of a gene mutation and the mode of inheritance varies between NM subclasses and different families. Mutations in six genes are known to cause NM; nebulin (NEB), alpha-actin, alpha-tropomyosin (TPM3), troponin T1, beta-tropomyosin (TPM2) and cofilin 2, of which nebulin and -actin are the most common. One of the main interests of my research is NEB. Nebulin is a giant muscle protein (600-900 kDa) expressed mainly in the thin filaments of striated muscle. Mutations in NEB are the main cause of autosomal recessive NM. The gene consists of 183 exons. Thus being gigantic, NEB is very challenging to investigate. NEB was screened for mutations using denaturing High Performance Liquid Chromatography (dHPLC) and sequencing. DNA samples from 44 families were included in this study, and we found and published 45 different mutations in them. To date, we have identified 115 mutations in NEB in a total of 96 families. In addition, we determined the occurrence in a world-wide sample cohort of a 2.5 kb deletion containing NEB exon 55 identified in the Ashkenazi Jewish population. In order to find the seventh putative NM gene a genome-wide linkage study was performed in a series of Turkish families. In two of these families, we identified a homozygous mutation disrupting the termination signal of the TPM3 gene, a previously known NM-causing gene. This mutation is likely a founder mutation in the Turkish population. In addition, we described a novel recessively inherited distal myopathy, named distal nebulin myopathy, caused by two different homozygous missense mutations in NEB in six Finnish patients. Both mutations, when combined in compound heterozygous form with a more disruptive mutation, are known to cause NM. This study consisted of molecular genetic mutation analyses, light and electron microscopic studies of muscle biopsies, muscle imaging and clinical examination of patients. In these patients the distribution of muscle weakness was different from NM. Nemaline bodies were not detectable with routine light microscopy, and they were inconspicuous or absent even using electron microscopy. No genetic cause was known to underlie cap myopathy, a congenital myopathy characterised by cap-like structures in the muscle fibres, until we identified a deletion of one codon of the TPM2 gene, in a 30-year-old cap myopathy patient. This mutation does not change the reading frame of the gene, but a deletion of one amino acid does affect the conformation of the protein produced. In summary, this thesis describes a novel distal myopathy caused by mutations in the nebulin gene, several novel nebulin mutations associated with nemaline myopathy, the first molecular genetic cause of cap myopathy, i.e. a mutation in the beta-tropomyosin gene, and a founder mutation in the alpha-tropomyosin gene underlying autosomal recessive nemaline myopathy in the Turkish population.

Myopatiat ovat usein perinnöllisiä, kliinisesti vaihtelevia poikkijuovaisen eli luurankolihaksen sairauksia, joiden oireena on vaikeusasteeltaan eriasteinen lihasheikkous. Se voi olla yleistä lihasheikkoutta, johonkin tiettyyn lihasryhmään liittyvää tai jopa yksittäisiin lihaksiin rajautunutta. Lisäksi diagnoosin perusteena on kreatiinikinaasin määrittäminen verestä, neurofysiologiset tutkimukset ja poikkijuovaisessa lihaksessa mikroskoopilla havaittavat poikkeavuudet. Tässä väitöskirjatyössä analysoitiin yli 300 DNA-näytettä, pääasiassa ulkomaalaisista perheistä, joissa lihastaudin taustalla uskottiin tai tiedettiin olevan häiriö lihassolun supistuvan yksikön, sarkomeerin, rakenneproteiineissa. Tutkimus keskittyi näitä proteiineja koodaavien geenien analysointiin. Väitöskirjan viidestä osatyöstä kolmessa tutkittiin nemaliinimyopatiaa (NEM), joka on yleisin perinnöllisten ns. kongenitaalisten (synnynnäisten tai rakenteellisten) myopatioiden muoto. NEM-potilaiden poikkijuovaisessa lihaksessa on valomikroskoopilla havaittavia proteiinikertymiä, nemaliinikappaleita. NEM johtuu yleensä geenivirheestä ja mutaatioita on löydetty kuudesta geenistä. Geeneistä jättimäinen 183 eksonia käsittävä nebuliini (NEB) sekä beta- ja gamma-tropomyosiinit (TPM2 ja TPM3) ovat väitöskirjassa keskeisiä. Tässä työssä käyttöönotettiin nestekromatografiamenetelmä NEB-mutaatioanalyysiä varten, ja analysoitiin 44 perheen DNA-näytteet, joista löydettiin 45 uutta mutaatiota. Lisäksi määritettiin askenaasijuutalaisilla esiintyvän tunnetun mutaation yleisyys NEM-potilailla ja todettiin, että kyseessä on maailmanlaajuinen perustajamutaatio. Sekä aikaisempien että tässä työssä tehtyjen analyysien perusteella on päätelty, että on olemassa vielä ainakin seitsemäs NEM-geeni. Tämän geenin kartoitusta varten tehtiin koko genomin laajuinen analyysi 13 turkkilaisperheelle. Tämän pohjalta löydettiin jo tunnetusta NEM-geenistä, TPM3, homotsygoottinen mutaatio kahdesta perheestä. Mutaatio poistaa geenistä lopetussignaalin ja johtaa ylipitkän proteiinin tuottamiseen. Vuoteen 2007 mennessä NEB-mutaatioita oli löytynyt ainoastaan NEM-potilailta. Tässä työssä löytyi NEB-mutaatioita neljästä suomalaisperheestä, joilla oli ennestään tuntematon, pääasiassa raajojen ääreisosiin vaikuttava lihassairaus. Tämä uusi lihassairaus nimettiin distaalinebuliinimyopatiaksi (DNM). DNM-potilailla ei ole valomikroskooppitasolla havaittavia proteiinikertymiä lihassoluissaan, mutta elektronimikroskopialla voidaan havaita sarkomeerirakenteen häiriöitä. Cap-myopatia (CM) -potilailla lihassolukalvon alle muodostuu laajoja proteiinikertymiä, ikään kuin lihassoluilla olisi lakit. Tämän sairauden geneettinen tausta oli vuoteen 2007 asti selvittämättä. Tässä työssä CM-potilaalta löydettiin heterotsygoottinen mutaatio TPM2-geenistä. Mutaatio vaikuttaa proteiinituotteen rakenteeseen. Tämän väitöskirjatyön tulokset valottavat rakenteellisten myopatioiden geneettistä taustaa paljastaen molekyyligeneettisten taustojen monimuotoisuuden ja kompleksisuuden. Tämäkin työ on osoittanut, että saman taudin taustalla saattaa olla useampi eri geeni, ja toisaalta sen, että saman geenin eri mutaatiot voivat aiheuttaa erilaisia tauteja. Geenivirheiden tunnistaminen on tärkeää paitsi diagnostiikan ja mahdollisten hoitojen kehittelylle myös lihassolun toiminnan paremmalle ymmärtämiselle.