Genetic alterations in microsatellite-unstable colorectal cancer

Colorectal cancer (CRC) is the third most common cancer in Finland. Of all CRC tumors, 15% display microsatellite-instability (MSI) caused by defective cellular mismatch repair. Cells displaying MSI accumulate a high number of mutations genome-wide, especially in short repeat areas, microsatellites. When targeting genes essential for cell growth or death, MSI can promote tumorigenesis. In non-coding areas, microsatellite mutations are generally considered as passenger events. Since the discovery of MSI and its linkage to cancer, more that 200 genes have been investigated for a role in MSI tumorigenesis. Although various criteria have been suggested for MSI target gene identification, the challenge has been to distinguish driver mutations from passenger mutations. This study aimed to clarify these key issues in the research field of MSI cancer. Prior to this, background mutation rate in MSI cancer has not been studied in a large-scale. We investigated the background mutation rate in MSI CRC by analyzing the spectrum of microsatellite mutations in non-coding areas. First, semenogelin I was studied for a possible role in MSI carcinogenesis. The intronic T9 repeat of semenogelin I was frequently mutated but no evidence for selection during tumorigenesis was obtained. Second, a sequencing approach was utilized to evaluate the general background mutation rate in MSI CRC. Both intronic and intergenic repeats harbored extremely high mutation rates of ≤ 87% and intergenic repeats were more unstable than the intronic repeats. As mutation rates of presumably neutral microsatellites can be high in MSI CRC in the absence of apparent selection pressure, high mutation frequency alone is not sufficient evidence for identification of driver MSI target genes. Next, an unbiased approach was designed to identify the mutatome of MSI CRC. By combining expression array data and a database search we identified novel genes possibly related to MSI CRC carcinogenesis. One of the genes was studied further. In the functional analysis this gene was observed to cause an abnormal cancer-prone cellular phenotype, possibly through altered responses to DNA damage. In our recent study, smooth muscle myosin heavy chain 11 (MYH11) was identified as a novel MSI CRC gene. Additionally, MYH11 has a well established role in acute myeloid leukemia (AML) through an oncogenic fusion protein CBFB-MYH11. We investigated further the role of MYH11 in AML by sequencing. Three novel missense variants of MYH11 were identified. None of the variants were present in the population-based control material. One of the identified variants, V71A, lies in the N-terminal SH3-like domain of MYH11 of unknown function. The other two variants, K1059E and R1792Q are located in the coil-coiled myosin rod essential for the regulation and filament formation of MYH11. The variant K1059E lies in the close proximity of the K1044N that has been functionally assessed in our earlier work of CRC and has been reported to cause total loss of MYH11 protein regulation. As the functional significance of the three novel variants examined in this work remains unknown, future studies should clarify the further role of MYH11 in AML leukaemogenesis and in other malignancies.

Paksu- ja peräsuolisyöpä (PPS) on Suomen kolmanneksi yleisin syöpä. Kaikista PPS-kasvaimista 15 % ilmentää ns. mikrosatelliitti-instabiliteettia (MSI). MSI johtuu virheellisesti toimivasta solujen ns. mismatch-repair-systeemistä, ja seurauksena MSI-soluissa mutaatioita kerääntyy koko genomin alueelle erityisesti toistojaksoihin eli mikrosatelliitteihin. Vaikuttaessaam esimerkiksi solun kasvulle tai solukuolemalle tärkeisiin geeneihin MSI voi altistaa syövän synnylle. Proteiineja koodaamattomilla genomin alueilla MSI-ilmiön on tähän saakka ajateltu aiheuttavan lähinnä taustamutaatioita. Yli 200 geeniä on tutkittu MSI PPS:ssä sen jälkeen, kun linkki MSI-ilmiön ja syövän välillä havaittiin. Monia kriteereitä MSI-kohdegeenien tunnistamiseen on esitetty, mutta kriteereistä huolimatta on haastavaa erottaa taustamutaatiot todellisista syöpää aiheuttavista mutaatioista. Tässä tutkimuksessa tavoitteenamme oli tutkia juuri näitä avainkysymyksiä MSI-syöpätutkimuksessa. Ensimmäisessä kahdessa osatyössä tutkimme taustamutaatioita MSI PPS kasvaimissa. Ensin tutkimme seminogelin I -geenin mahdollista roolia paksusuolisyövässä, mutta yhteyttä syövän synnylle ja semenogelin I geenin T9-toistojakson mutaatioille ei havaittu. Toisessa osatyössä havaitsimme, että intergeenisillä ja intronisilla mikrosatelliittialueilla oli paljon taustamutaatioita ja introniset alueet olivat epästabiilimpia kuin intergeeniset vastaavat mikrosatelliittitoistojaksot. Kolmannessa osatyössä pyrimme tunnistamaan genomin laajuisella lähestymistavalla uusia MSI PPS kohdegeenejä mikrosiruteknologian ja genomin tietokantojen avulla. Yksi geeneistä valittiin tarkempiin analyyseihin, ja osoittautui, että kyseinen geeni saattaa olla tärkeä MSI PPS:n synnylle, mahdollisesti aiheuttaen viallisen vasteen solun DNA:n vauriolle. Neljännessä osatyössä tutkimme MYH11-geenin roolia akuutissa myelooisessa leukemiassa (AML). MYH11 tunnistettiin hiljattain alttiusgeeniksi MSI PPS-kasvaimissa, ja aiemmista tutkimuksista tiedetään, että osassa AML-tapauksia MYH11 on osana onkogeenistä fuusioproteiinia CBFB-MYH11. Sekvensoimme koko MYH11-geenin 40 AML-näytteellä, ja tunnistimme 3 aiemmin julkaisematonta geenivarianttia. MYH11-proteiinin rakenteen perusteella kaksi kolmesta variantista saattaa olla tärkeä MYH11-geenin toiminnalle, mutta lisätutkimuksia tarvitaan näiden varianttien merkityksen selvittämiseksi AML:n synnyssä.