Molecular pathogenesis of human parechovirus 1 infection

The Parechoviruses (HPEV) belong to the family Picornaviridae of positive-stranded RNA viruses. Although the parechovirus genome shares the general properties of other picornaviruses, the genus has several unique features when compared to other family members. We found that HPEV1 attaches to αv integrins on the cell surface and is internalized through the clathrin-mediated endocytic pathway. During he course of the infection, the Golgi was found to disintegrate and the ER membranes to swell and loose their ribosomes. The replication of HPEV1 was found to take place on small clusters of vesicles which contained the trans-Golgi marker GalT as well as the viral non-structural 2C protein. 2C was additionally found on stretches of modified ER-membranes, seemingly not involved in RNA replication. The viral non-structural 2A and 2C proteins were studied in further detail and were found to display several interesting features. The 2A protein was found to be a RNA-binding protein that preferably binds to positive sense 3 UTR RNA. It was found to bind also duplex RNA containing 3 UTR(+)-3 UTR(-), but not other dsRNA molecules studied. Mutagenesis revealed that the N-terminal basic-rich region as well as the C-terminus, are important for RNA-binding. The 2C protein on the other hand, was found to have both ATP-diphosphohydrolase and AMP kinase activities. Neither dATP nor other NTP:s were suitable substrates. Furthermore, we found that as a result of theses activities the protein is autophosphorylated. The intracellular changes brought about by the individual HPEV1 non-structural proteins were studied through the expression of fusion proteins. None of the proteins expressed were able to induce membrane changes similar to those seen during HPEV1 infection. However, the 2C protein, which could be found on the surface of lipid droplets but also on diverse intracellular membranes, was partly relocated to viral replication complexes in transfected, superinfected cells. Although Golgi to ER traffic was arrested in HPEV1-infected cells, none of the individually expressed non-structural proteins had any visible effect on the anterograde membrane traffic. Our results suggest that the HPEV1 replication strategy is different from that of many other picornaviruses. Furthermore, this study shows how relatively small differences in genome sequence result in very different intracellular pathology.

Picornavirusen är en stor familj av små RNA-virus utan yttre membran. De kanske mest kända picornavirusen är poliovirusen, men till gruppen hör även rhinovirusen, som ger upphov till de flesta febersnuvor, enterovirusen som orsakar neurologiska, respiratoriska och gastrointestinala symptom samt hepatit A-virus. Bland familjemedlemmarna finns även djurpatogener. Human parechovirus 1 och 2 (HPEV1 och HPEV2) upptäcktes 1956. Redan vid den ursprungliga karakteriseringen uppmärksammades dock dessa virus ovanliga tillväxtegenskaper samt cytopatologi. Med hjälp av sekvensanalys har man senare kunnat visa att parechovirusen har flera unika molekylbiologiska egenskaper.HPEV1-infektioner är mycket vanliga, speciellt bland små barn, och ofta asymptomatiska, men de kan dock även orsaka ett flertal olika kliniska symptom, däribland gastroenterit, respiratoriska infektioner, infektioner av centrala nervsystemet och myokardit. HPEV1 har ett positiv-strängat RNA-genom som är 7100 nukleotider långt. RNAt kodar för ett ca 230 aminosyror långt polyprotein som bearbetas av virusets egna proteaser till mindre enheter. Slutprodukterna indelas i kapsidprotein (VP0, VP1 och VP3) och ickekapsidprotein (2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 3D). Sextio kopior av vart och ett av de tre kapsidproteinen bygger upp den ikosahedrala kapsid som innehåller virusets genom. Till icke-kapsidproteinen hör t.ex. enzym som är nödvändiga för virusets replikation. I mitt första delprojekt undersökte vi HPEV1:s interaktion med cellens yta. Vi fann att HPEV1 binder vid αvβ3-integrin på cellens yta och internaliseras med hjälp av clathrinmedierad endocytos. I mitt andra delprojekt undersökte vi, med hjälp av främst elektronmikroskopiska tekniker, de förändringar som HPEV1 orsakar i den infekterade cellen. Med hjälp av RNA-sonder kunde vi lokalisera den plats i cellen där virusets genom replikeras. Våra studier visade att HPEV1:s replikationskomplex skiljer sig avsevärt från de replikationskomplex som kan iakttas vid infektion med andra picornavirus. Vid elektronmikroskopi av HPEV1-infekterade celler kunde vi se att dessa hade ett avvikande, dilaterat endoplasmatiskt retikulum samt en disintegrerad Golgiapparat. Vi fann att 2C-proteinet, som vid andra pikornavirusinfektioner är lokaliserat uteslutande till virusets replikationskomplex, i HPEV1-infekterade celler därutöver kan återfinnas i en struktur som inte deltar i virusets RNA syntes. Vi kunde även konstatera att HPEV1:s RNA syntetiseras på ytan av oregelbundna vesikler som verkar vara av Golgiursprung. I det tredje delprojektet undersökte vi 2A-proteinet. Parechovirusens 2A-kodande gensekvens skiljer sig markant från motsvarande gensekvens hos andra picornavirus. För att utreda 2A:s möjliga funktioner producerade vi antikroppar mot proteinet och lokaliserade det i den infekterade cellen med hjälp av immunofluorescens- och konfokalmikroskopi. Merparten av proteinet återfanns i cellens cytoplasma, men i senare skeden av infektionen även i cellkärnan. Med hjälp av olika biokemiska analyser utredde vi 2A-proteinets förmåga att binda till RNA. Vi fann att proteinet har största affinitet för den icke-kodande sekvensen i slutet på HPEV1:s RNA. Med hjälp av mutationsanalys kunde vi bestämma att proteinets amino-ända är nödvändig för protein-RNA-bindingen. I det fjärde delprojeketet undersökte vi 2C-proteinets förmåga att hydrolysera tri-fosfatnukleotider. Vi fann att proteinet kunde hydrolysera ATP och ADP, men inte CTP eller GTP. Till vår förvåning fann vi att 2C proteinet även fungerade som ett monofosfatkinas; i en energikrävande reaktion kunde proteinet tillverka ADP av AMP och fosfat. Därtill kunde vi konstatera att proteinet som en följd härav blev fosforylerat, något som eventuellt kan reglera proteinets funktion. I det femte delprojektet uttryckte vi de enskilda 2B-, 2BC-, 2C-, 3A- och 3AB-proteinen i cellodlingar och undersökte de förändringar proteinen orsakar i de intracellulära strukturerna. Vi fann att 2B-proteinet lokaliserades till det endoplasmatiska retiklet medan 2BC och 2C återfanns på ytan av lipidvesikler och 3A och 3AB i Golgiapparaten. Inget av proteinen var förmöget att i sig orsaka de förändringar som observeras i HPEV1- infekterade celler. Resultaten tyder på att HPEV1:s replikationsstrategi skiljer sig markant från replikationsstrategin hos andra studerade picornavirus samt att relativt små skillnader i virusens genom kan leda till stora skillnader i virusens intracellulära patologi.