Fibroblast nemosis in malignant progression of epithelial cells

Paracrine regulation between the components of the tumour microenvironment cancer cells, activated fibroblasts, immune and endothelial cells is under intense investigation. The signals between the different cell types are mediated by soluble factors, such as growth factors, proinflammatory cytokines and proteolytic enzymes. Nemosis is an experimental in vitro model of fibroblast activation, leading to increased production of such mediators. Nemotic activation of fibroblasts occurs as they are forced to cluster thereby forming a multicellular spheroid. The aim of the present studies was to elucidate the mechanisms underlying the nemotic response of cancer-associated fibroblasts (CAF) and the role of nemosis in paracrine regulation between activated fibroblasts and benign and malignant epithelial cells. The results presented in this thesis demonstrate that the nemotic response of CAFs and normal fibroblasts differs, and inter-individual variations exist between fibroblast populations. In co-culture experiments, fibroblasts increased colony formation of squamous cell carcinoma (SCC) cells, and CAFs further augmented this, highlighting the tumour-evolving properties of CAFs. Furthermore, fibroblast monolayers in those co-cultures started to cluster spontaneously. This kind of spontaneous nemosis response might take place also in vivo, although more direct evidence of this still needs to be obtained. The HaCaT skin carcinoma progression model was used to study the effects of benign and malignant keratinocytes on fibroblast nemosis. Benign HaCaT cells inhibited fibroblast nemosis, observed as inhibition of cyclooxygenase 2 (COX-2) induction in nemotic spheroids. In contrast, malignant HaCaTs further augmented the nemotic response by increasing expression of COX-2 and the growth factors hepatocyte growth factor / scatter factor (HGF/SF) and vascular endothelial growth factor (VEGF), as well as causing a myofibroblastic differentiation of nemotic fibroblasts into fibroblasts resembling CAFs. On the other side of this reciprocal signalling, factors secreted into conditioned medium by the nemotic fibroblasts promoted proliferation and motility of the HaCaT cell lines. Notably, the nemotic fibroblast medium increased the expression of p63, a transcription factor linked to carcinogenesis, also in the highly metastatic HaCaT cells. These results emphasize the paracrine role of factors secreted by activated fibroblasts in driving tumour progression. We also investigated the epithelial-mesenchymal transition (EMT) of the HaCaT clones in response to transforming growth factor β (TGF-β), which is a well-characterized inducer of EMT. TGF-β caused growth arrest and loss of epithelial cell junctions in the HaCaT derivatives, but mesenchymal markers were not induced, suggesting a partial, but not complete EMT response. Inflammation induced by COX-2 has been proposed to be a key mechanism in EMT of benign cells. Corroborating this notion, COX-2 was induced only in benign, not in malignant HaCaT derivatives. Furthermore, in cells in which TGF-β caused COX-2 induction, migration was clearly augmented. The concept of treating cancer is changing from targeting solely the cancer cells to targeting the whole microenvironment. The results of this work emphasise the role of activated fibroblasts in cancer progression and that CAFs should also be taken into consideration in the treatment of cancer. The results from these studies suggests that nemosis could be used as a diagnostic tool to distinguish in vitro activated fibroblasts from tumour stroma and also in studying the paracrine signalling that is mediated to other cell types via soluble factors.

Syöpäkasvaimet eivät ole eristäytyneet muusta elimistöstä, vaan syöpäsolut ovat tiiviissä vuorovaikutuksessa ympäröivien solujen, kuten aktivoituneiden sidekudos-, puolustus- ja verisuonisolujen kanssa. Valtaosa syövistä on lähtöisin epiteelistä, joka on kudosten pintoja päällystävä kerros; näistä syövistä käytetään nimitystä karsinooma. Sidekudoksen pääasiallinen solutyyppi on mesenkymaalinen fibroblasti. Liukoiset tekijät välittävät signaaleja näiden eri solutyyppien välillä, edistäen täten syövän kasvua ja leviämistä. Kasvainten mikroympäristön tutkimuksen avulla pyritään löytämään uusia hoitomuotoja syöpätauteihin. Nemoosi on tutkimusryhmämme kehittämä kokeellinen fibroblastien aktivoitumisen malli. Väitöskirjatutkimuksen tarkoituksena oli selvittää nemoosi-mallia hyödyntäen, miten aktivoituneiden fibroblastien tuottamat liukoiset tekijät vaikuttavat epiteelisolujen muuttumiseen hyvänlaatuisesta pahanlaatuisiksi. Väitöskirjan ensimmäisessä osatyössä tutkittiin suusyöpäpotilaista eristettyjen normaalien ja kasvaimen fibroblastien nemoosi-vastetta ja vuorovaikutusta levyepiteelistä lähtöisin olevien karsinoomasolujen kanssa. Kasvaimen fibroblastit aktivoituivat eri tavalla normaaleihin verrattuna ja ne edistivät karsinoomasolujen kasvua. Toisessa työssä käytettiin ihon pintakerroksen keratinosyyteistä koostuvaa HaCaT-solupaneelia, joka sisältää kaksi hyvän- ja kaksi pahanlaatuista solulinjaa. Hyvänlaatuiset HaCaT-solut ehkäisivät fibroblastien aktivoitumista. Vastaavasti pahanlaatuiset HaCaT-solut edistivät nemoosi-vastetta, lisäten fibroblastien tuottaman syklo-oksigenaasi 2 (COX-2) tulehdustekijän, hepatosyyttikasvutekijän (HGF/SF) ja verisuonikasvutekijän (VEGF) määrää. Kolmannessa osajulkaisussa tutkittiin, kuinka nämä aktivoituneiden fibroblastien tuottamat liukoiset tekijät vaikuttavat HaCaT-solupaneelin eriasteisten solujen käyttäytymiseen. Nemoottisten fibroblastien kasvatusliuokseen erittämät tekijät lisäsivät HaCaT-solulinjojen jakautumis- ja liikkumiskapasiteettia. Nemoosi ei kuitenkaan aikaansaanut näiden epiteelisolujen muuttumista mesenkymaalisiksi. HaCaT-solupaneelin epiteeli-mesenkyymitransformaatiota (EMT) tutkittiin väitöskirjan neljännessä osassa. Transformoiva kasvutekijä beta (TGF-beta) on tunnettu EMT-aiheuttaja, ja sen todettiin pysäyttävän kaikkien HaCaT-solulinjojen jakautumisen ja johtavat epiteelisolujen välisten solu-solu liitoksien heikkenemiseen. Soluliitoksien katoaminen mahdollistaa epiteelisolujen yksittäisen liikkumisen. TGF-beta sai aikaan COX-2 entsyymin tuotannon hyvän- mutta ei pahanlaatuisissa HaCaT-soluissa ja samalla lisäsi näiden solujen liikkumiskapasiteettia. Tämä väitöskirjatyö osoittaa mikroympäristön, ja erityisesti aktivoituneiden fibroblastien, olevan olennainen osa kasvaimen kehittymisessä pahanlaatuiseksi. Näiden solujen rooli tulisi huomioida kehitettäessä syöpähoitoja. Työn tulokset osoittavat myös, että nemoosi-mallia voidaan mahdollisesti jatkossa hyödyntää karsinoomien patogeneesi-, diagnostiikka- ja hoitotutkimuksissa.