Molecular basis of the kidney filtration barrier : Role of the nephrin protein complex

The kidney filtration barrier consists of fenestrated endothelial cell layer, glomerular basement membrane and slit diaphragm (SD), the specialized junction between glomerular viscelar epithelial cells (podocytes). Podocyte injury is associated with the development of proteinuria, and if not reversed the injury will lead to permanent deterioration of the glomerular filter. The early events are characterized by disruption of the integrity of the SD, but the molecular pathways involved are not fully understood. Congenital nephrotic syndrome of the Finnish type (CNF) is caused by mutations in NPHS1, the gene encoding the SD protein nephrin. Lack of nephrin results in loss of the SD and massive proteinuria beginning before birth. Furthermore, nephrin expression is decreased in acquired human kidney diseases including diabetic nephropathy. This highlights the importance of nephrin and consequently SD in regulating the kidney filtration function. However, the precise molecular mechanism of how nephrin is involved in the formation of the SD is unknown. This thesis work aimed at clarifying the role of nephrin and its interaction partners in the formation of the SD. The purpose was to identify novel proteins that associate with nephrin in order to define the essential molecular complex required for the establishment of the SD. The aim was also to decipher the role of novel nephrin interacting proteins in podocytes. Nephrin binds to nephrin-like proteins Neph1 and Neph2, and to adherens junction protein P-cadherin. These interactions have been suggested to play a role in the formation of the SD. In this thesis work, we identified densin as a novel interaction partner for nephrin. Densin was localized to the SD and it was shown to bind to adherens junction protein beta-catenin. Furthermore, densin was shown to behave in a similar fashion as adherens junction proteins in cell-cell contacts. These results indicate that densin may play a role in cell adhesion and, therefore, may contribute to the formation of the SD together with nephrin and adherens junction proteins. Nephrin was also shown to bind to Neph3, which has been previously localized to the SD. Neph3 and Neph1 were shown to induce cell adhesion alone, whereas nephrin needed to trans-interact with Neph1 or Neph3 from the opposite cell surface in order to make cell-cell contacts. This was associated with the decreased tyrosine phosphorylation of nephrin. These data extend the current knowledge of the molecular composition of the nephrin protein complex at the SD and also provide novel insights of how the SD may be formed. This thesis work also showed that densin was up-regulated in the podocytes of CNF patients. Neph3 was up-regulated in nephrin deficient mouse kidneys, which share similar podocyte alterations and lack of the SD as observed in CNF patients podocytes. These data suggest that densin and Neph3 may have a role in the formation of morphological alterations in podocytes detected in CNF patients. Furthermore, this thesis work showed that deletion of beta-catenin specifically from adult mouse podocytes protected the mice from the development of adriamycin-induced podocyte injury and proteinuria compared to wild-type mice. These results show that beta-catenin play a role in the adriamycin induced podocyte injury. Podocyte injury is a hallmark in many kidney diseases and the changes observed in the podocytes of CNF patient share characteristics with injured podocytes observed in chronic kidney diseases. Therefore, the results obtained in this thesis work suggest that densin, Neph3 and beta-catenin participate in the molecular pathways which result in morphological alterations commonly detected in injured podocytes in kidney diseases.

Valkuaisvirtsaisuus on yleinen munuaiskeräsen suodatusrakenteen toimintahäiriöstä kertova oire, joka voi johtaa pysyviin munuaismuutoksiin ja pahimmissa tapauksissa dialyysiin ja munuaissiirtoon. Veri suodattuu munuaiskeräsissä endoteelisolujen, tyvikalvon ja podosyyttien muodostaman soluliitoksen eli välihilan (engl. slit diaphragm) läpi. Viimeisen kymmenen vuoden aikana tehdyt ihmisgenetiikkatutkimukset sekä poistogeeniset hiirimallit ovat osoittaneet, että viallisten välihilan proteiinien tuottaminen johtaa podosyyttien morfologisiin muutoksiin ja valkuaisvirtsaisuuteen. Nefriini kuuluu näihin proteiineihin, sillä mutaatio nefriiniä ilmentävässä geenissä aiheuttaa suomalaistyyppisen synnynnäisen nefroosin (CNF). CNF-potilailta puuttuu välihilat, ja heillä on jo syntyessään voimakasta valkuaisvirtsaisuutta, joka hoidetaan munuaissiirrolla varhaisessa iässä. Nefriinin ilmentyminen on myös vähentynyt muun muassa diabeettisessa munuaissairaudessa. Molekulaarinen mekanismi, jolla nefriini yhdessä muiden proteiinien kanssa muodostaa välihilan, ei ole tarkkaan tiedossa. Väitöskirjatyössä on etsitty uusia proteiineja, jotka sitoutuvat nefriiniin, ja selvitetty näiden proteiinien toimintaa podosyyttien välihilan muodostumisessa ja vaurioitumisessa. Väitöskirjatyössä löydettiin nefriiniin sitoutuva proteiini densiini, joka paikannettiin välihilaan. Densiinin osoitettiin sitoutuvan soluliitosproteiinii beta-kateniiniin, jonka on osoitettu olevan tärkeä soluliitosten muodostumiselle. Koska densiinin näytettiin käyttäytyvän soluliitoksissa samalla tavalla kuin beta-kateniinin, on mahdollista, että densiini osallistuu soluadheesioon ja on siten kenties mukana myös podosyyttien välisen soluliitoksen muodostumisessa yhdessä nefriinin ja beta-kateniinin kanssa. Tämän lisäksi väitöskirjatyössä tehtiin muuntogeeninen hiiri, jolta poistettiin beta-kateniini aikuisten hiirten podosyyteiltä. Kun näille hiirille aiheutettiin munuaisvaurio adriamysiinillä, ne kehittivät lievemmän podosyyttivaurion ja valkuaisvirtsaisuuden kuin normaalit hiiret. Tämä osoittaa, että beta-kateniinilla on rooli podosyyttivaurion muodostumisessa adriamysiinillä aiheutetussa nefroosissa. Munuaisissa ilmenee ainakin kolme nefriinin kaltaista proteiinia, proteiinit Neph1, Neph2 ja Neph3. Näistä Neph1:n ja Neph2:n on aiemmin osoitettu sitoutuvan nefriiniin. Väitöskirjatyössä osoitettiin, että nefriini sitoutuu myös Neph3-proteiiniin, joka on aikaisemmin paikannettu välihilaan. Lisäksi osoitettiin, että Neph1 ja Neph3 osallistuvat soluadheesioon yksin, kun taas nefriinin pitää sitoutua vastakkaisen solun pinnalla oleviin Neph1- tai Neph3-proteiineihin, jotta soluliitos voi syntyä. Nefriinin on aikaisemmin näytetty fosforyloituvan, jonka on osoitettu liittyvän solusignalointiin. Väitöskirjatyössä näytettiin, että nefriinin muodostaessa soluliitoksen yhdessä Neph1- tai Neph3-proteiinien kanssa nefriinin fosforylaatio vähenee. Tämän perusteella on mahdollista, että nefriini osallistuu kyseisten proteiinien kanssa myös välihilan muodostumiseen. Myös nefriinin fosforylaatiolla voi olla merkitystä välihilan muodostumisessa. Myös muissa munuaissairauksissa kuin CNF:ssä potilaissa on havaittu vastaavia muutoksia podosyyttisolujen rakenteessa ja välihiloissa. Tämän vuoksi on tärkeää tutkia, mitkä proteiinit vaikuttavat näiden muutosten syntymiseen. Väitöskirjatyössä havaittiin densiini-proteiinia enemmän CNF-potilaiden podosyyteissä kuin terveissä kontrolleissa. Neph3-proteiinin tason havaittiin podosyyteissä myös nousevan muuntogeenisissä hiirissä, joilta puuttuu nefriini ja joille kehittyy samankaltaisia podosyyttimuutoksia kuin CNF-potilaille. Nämä tutkimukset osoittavat, että densiinillä ja Neph3:lla saattaa olla rooli CNF-potilaiden podosyyttimuutosten muodostumisessa ja mahdollisesti myös muissa munuaissairauksissa. Väitöskirjatyössä tehdyt tutkimukset tarjoavat uutta arvokasta tietoa niistä molekulaarisista mekanismeista, jotka saattavat olla mukana välihilan muodostumisessa ja vaurioitumisessa, ja tulokset saattavat siten auttaa uusien lääkekehityskohteiden tunnistamisessa.