Genotyping for genetic association studies: Methods and applications

In this thesis, two separate single nucleotide polymorphism (SNP) genotyping techniques were set up at the Finnish Genome Center, pooled genotyping was evaluated as a screening method for large-scale association studies, and finally, the former approaches were used to identify genetic factors predisposing to two distinct complex diseases by utilizing large epidemiological cohorts and also taking environmental factors into account. The first genotyping platform was based on traditional but improved restriction-fragment-length-polymorphism (RFLP) utilizing 384-microtiter well plates, multiplexing, small reaction volumes (5 µl), and automated genotype calling. We participated in the development of the second genotyping method, based on single nucleotide primer extension (SNuPeTM by Amersham Biosciences), by carrying out the alpha- and beta tests for the chemistry and the allele-calling software. Both techniques proved to be accurate, reliable, and suitable for projects with thousands of samples and tens of markers. Pooled genotyping (genotyping of pooled instead of individual DNA samples) was evaluated with Sequenom s MassArray MALDI-TOF, in addition to SNuPeTM and PCR-RFLP techniques. We used MassArray mainly as a point of comparison, because it is known to be well suited for pooled genotyping. All three methods were shown to be accurate, the standard deviations between measurements being 0.017 for the MassArray, 0.022 for the PCR-RFLP, and 0.026 for the SNuPeTM. The largest source of error in the process of pooled genotyping was shown to be the volumetric error, i.e., the preparation of pools. We also demonstrated that it would have been possible to narrow down the genetic locus underlying congenital chloride diarrhea (CLD), an autosomal recessive disorder, by using the pooling technique instead of genotyping individual samples. Although the approach seems to be well suited for traditional case-control studies, it is difficult to apply if any kind of stratification based on environmental factors is needed. Therefore we chose to continue with individual genotyping in the following association studies. Samples in the two separate large epidemiological cohorts were genotyped with the PCR-RFLP and SNuPeTM techniques. The first of these association studies concerned various pregnancy complications among 100,000 consecutive pregnancies in Finland, of which we genotyped 2292 patients and controls, in addition to a population sample of 644 blood donors, with 7 polymorphisms in the potentially thrombotic genes. In this thesis, the analysis of a sub-study of pregnancy-related venous thromboses was included. We showed that the impact of factor V Leiden polymorphism on pregnancy-related venous thrombosis, but not the other tested polymorphisms, was fairly large (odds ratio 11.6; 95% CI 3.6-33.6), and increased multiplicatively when combined with other risk factors such as obesity or advanced age. Owing to our study design, we were also able to estimate the risks at the population level. The second epidemiological cohort was the Helsinki Birth Cohort of men and women who were born during 1924-1933 in Helsinki. The aim was to identify genetic factors that might modify the well known link between small birth size and adult metabolic diseases, such as type 2 diabetes and impaired glucose tolerance. Among ~500 individuals with detailed birth measurements and current metabolic profile, we found that an insertion/deletion polymorphism of the angiotensin converting enzyme (ACE) gene was associated with the duration of gestation, and weight and length at birth. Interestingly, the ACE insertion allele was also associated with higher indices of insulin secretion (p=0.0004) in adult life, but only among individuals who were born small (those among the lowest third of birth weight). Likewise, low birth weight was associated with higher indices of insulin secretion (p=0.003), but only among carriers of the ACE insertion allele. The association with birth measurements was also found with a common haplotype of the glucocorticoid receptor (GR) gene. Furthermore, the association between short length at birth and adult impaired glucose tolerance was confined to carriers of this haplotype (p=0.007). These associations exemplify the interaction between environmental factors and genotype, which, possibly due to altered gene expression, predisposes to complex metabolic diseases. Indeed, we showed that the common GR gene haplotype associated with reduced mRNA expression in thymus of three individuals (p=0.0002).

Yhden nukleotidin muutos (SNP; single nucleotide polymorphism) on yleisin yksilöiden välistä vaihtelua aiheuttava tekijä ihmisen perimässä. Siksi SNP:t ovat käyttökelpoisimpia geenimerkkejä monitekijäisille taudeille altistavien geenien tunnistamisessa, ja SNP-genotyyppausmenetelmien kehittäminen on viime vuosina ollut tärkeää. Monitekijäisten tautien alttiusgeenien tunnistaminen on kuitenkin osoittautunut vaikeaksi, koska yhden geenin sijaan taustalla saattaa olla useampi geeni sekä geenien ja ympäristötekijöiden yhteisvaikutukset. Tässä väitöskirjatyössä pystytettiin sekä restriktioentsyymipilkontaan että minisekvensointiin perustuvat SNP-genotyyppausmenetelmät Suomen genomikeskukseen, jotta suuren mittakaavan genotyyppaus olisi mahdollista. Näiden menetelmien toimivuutta arvioitiin sovelluksessa, jossa alleelien esiintyvyys määritetään yhdistetyistä DNA-näytteistä yksittäisten DNA-näytteiden sijaan. Lopuksi menetelmiä käytettiin monitekijäisille taudeille altistavien geneettisten tekijöiden tunnistamiseksi kahdessa erillisessä tutkimuksessa, joissa myös ympäristötekijöiden vaikutus huomioitiin. Alleelifrekvenssien määrittäminen yhdistetyistä DNA-näytteistä voi säästää merkittävästi genotyyppauskuluja sekä työhön käytettyä aikaa. Totesimme testattujen genotyyppausmenetelmien toimivan tarkasti tässä sovelluksessa. Esimerkkitautina käytimme kloridiripulia, jonka geenivirhe on tunnettu. Määritimme tautigeenin alueella sijaitsevien SNP:ien alleelifrekvenssit tapaus-, verrokki- ja kantajaryhmistä. Suurin ja tilastollisesti erittäin merkitsevä alleelifrekvenssiero tapausten ja verrokkien välillä havaittiin tautigeeniä ympäröivillä SNP:eillä. Kloridiripuliin assosioituva alue perimässä olisi näin ollen saatu rajattua hyvin kapeaksi käyttämällä yksittäisten näytteiden sijaan yhdistettyjä näytteitä. Vaikka sovellus toimii hyvin perinteisessä tapaus-verrokki -asetelmassa, sitä on vaikea soveltaa tutkimukseen, jossa myös ympäristötekijöiden vaikutus huomioidaan. Siksi seuraavissa assosiaatiotutkimuksissa käytimme yksittäisiä DNA-näytteitä. Restriktioentsyymipilkontaan perustuvaa menetelmää käytimme osatyössä, jonka tavoitteena oli selvittää sekä geneettisten että hankinnaisten altistavien tekijöiden aiheuttaman laskimotukosvaaran suuruus raskauden ja lapsivuoteuden aikana. Tutkimus on osa suurempaa kokonaisuutta, jossa tarkastellaan 100 000 perättäistä raskautta ja niiden aikana tapahtuneita raskauskomplikaatioita. Tutkituista geneettisistä tekijöistä ainoastaan FV Leiden osoittautui erittäin voimakkaaksi laskimotukosriskitekijäksi raskauden aikana. FV Leiden yhdessä muiden altistavien tekijöiden, kuten korkean iän ja ylipainon kanssa, nosti raskauden aikaisen laskimotukosriskin hälyttävän korkeaksi. Käytetyn tutkimusasetelman ansiosta pystyimme myös laskemaan aikaisemmista tutkimuksista usein puuttuneet väestötason riskit. Pienen syntymäkoon on osoitettu altistavan aikuisiän sairauksille, kuten tyypin 2 diabetekselle sekä sydän- ja verisuonitaudeille. Ilmiö on selitetty mm. sikiön ohjelmoitumisella: epäsuotuisat olosuhteet jo sikiöaikana muodostavat riskin sairastua aikuisiällä. Pienen syntymäkoon ja aikuisiän sairauksien välinen yhteys on toisaalta selitetty yhteisillä geneettisillä tekijöillä. Tavoitteenamme oli tutkia tämän ilmiön mekanismeja etsimällä geenimuotoja jotka muokkaavat pienen syntymäkoon merkitsemää alttiutta sairastua mm. tyypin 2 diabetekseen ja heikentyneeseen glukoosinsietoon. Käytetyt genotyyppausmenetelmät perustuivat PCR:ään ja minisekvensointiin. Kliinisiin tutkimuksiin osallistui 500 naista ja miestä, jotka olivat syntyneet vuosina 1924 1933 Helsingissä, ja joiden tarkat syntymämitat olivat tiedossa. Osoitimme ACE-geenin insertio/deleetio-polymorfismin assosioituvan raskauden kestoon sekä syntymäpainoon ja -pituuteen. Lisäksi insertio-alleeli assosioitui mm. lisääntyneeseen insuliinin eritykseen aikuisiällä, ainoastaan kuitenkin yksilöillä jotka olivat syntyneet pienikokoisina. Syntymämittoihin assosioitui myös yleinen GR-haplotyyppi, joka lisäksi assosioitui kohonneeseen paastokortisoli- ja glukoosipitoisuuteen sekä heikentyneeseen glukoosinsietoon, jälleen ainoastaan pienikokoisina syntyneillä. Osoitimme kyseisen haplotyypin assosioituvan alentuneeseen GR-geenin ilmentymiseen. Nämä löydökset osoittavat mielenkiintoisen vuorovaikutuksen geneettisten- ja ympäristötekijöiden välillä.