Molecular basis of colorectal cancer predisposition

Colorectal cancer (CRC) is one of the most frequent malignancies in Western countries. Inherited factors have been suggested to be involved in 35% of CRCs. The hereditary CRC syndromes explain only ~6% of all CRCs, indicating that a large proportion of the inherited susceptibility is still unexplained. Much of the remaining genetic predisposition for CRC is probably due to undiscovered low-penetrance variations. This study was conducted to identify germline and somatic changes that contribute to CRC predisposition and tumorigenesis. MLH1 and MSH2, that underlie Hereditary non-polyposis colorectal cancer (HNPCC) are considered to be tumor suppressor genes; the first hit is inherited in the germline and somatic inactivation of the wild type allele is required for tumor initiation. In a recent study, frequent loss of the mutant allele in HNPCC tumors was detected and a new model, arguing against the two-hit hypothesis, was proposed for somatic HNPCC tumorigenesis. We tested this hypothesis by conducting LOH analysis on 25 colorectal HNPCC tumors with a known germline mutation in the MLH1 or MSH2 genes. LOH was detected in 56% of the tumors. All the losses targeted the wild type allele supporting the classical two-hit model for HNPCC tumorigenesis. The variants 3020insC, R702W and G908R in NOD2 predispose to Crohn s disease. Contribution of NOD2 to CRC predisposition has been examined in several case-control series, with conflicting results. We have previously shown that 3020insC does not predispose to CRC in Finnish CRC patients. To expand our previous study the variants R702W and G908R were genotyped in a population-based series of 1042 Finnish CRC patients and 508 healthy controls. Association analyses did not show significant evidence for association of the variants with CRC. Single nucleotide polymorphism (SNP) rs6983267 at chromosome 8q24 was the first CRC susceptibility variant identified through genome-wide association studies. To characterize the role of rs6983267 in CRC predisposition in the Finnish population, we genotyped the SNP in the case-control material of 1042 cases and 1012 controls and showed that G allele of rs6983267 is associated with the increased risk of CRC (OR 1.22; P=0.0018). Examination of allelic imbalance in the tumors heterozygous for rs6983267 revealed that copy number increase affected 22% of the tumors and interestingly, it favored the G allele. By utilizing a computer algorithm, Enhancer Element Locator (EEL), an evolutionary conserved regulatory motif containing rs6983267 was identified. The SNP affected the binding site of TCF4, a transcription factor that mediates Wnt signaling in cells, and has proven to be crucial in colorectal neoplasia. The preferential binding of TCF4 to the risk allele G was showed in vitro and in vivo. The element drove lacZ marker gene expression in mouse embryos in a pattern that is consistent with genes regulated by the Wnt signaling pathway. These results suggest that rs6983267 at 8q24 exerts its effect in CRC predisposition by regulating gene expression. The most obvious target gene for the enhancer element is MYC, residing ~335 kb downstream, however further studies are required to establish the transcriptional target(s) of the predicted enhancer element.

Paksusuolisyöpä kuuluu kolmen yleisimmän syövän joukkoon maailmassa. Perintötekijoillä arvellaan olevan vaikutusta noin 35 %:ssa paksusuolisyövistä. Paksusuolisyövälle altistavat, dominantisti periytyvät syndroomat kattavat vain noin 6 % kaikista paksusuolisyöpätapauksista. Näin ollen suuri osa alttiusgeeneistä on vielä tunnistamatta ja tällä hetkellä uskotaan, että niin sanotut alhaisen riskin geenimuutokset voisivat selittää suuren osan perinnöllisestä paksusuolisyöpäalttiudesta. Väitöskirjatutkimukseni tarkoituksena oli tunnistaa uusia paksusuolisyövälle altistavia geenimuutoksia sekä tutkia somaattisia mekanismeja, jotka johtavat kasvaimen syntyyn. Perityvä ei-polypoottinen paksusuolisyöpä (Hereditary non-polyposis colorectal cancer, HNPCC) johtuu ituradan virheistä ns. mismatch repair geeneissä (esim. MLH1 ja MSH2). Kasvaimen syntyminen edellyttää villityypin alleelin somaattista inaktivoimista kohdekudoksessa. Ensimmäisessä osatyössä tutkimme mekanismeja, joilla MLH1- ja MSH2-geenit inaktivoidaan HNPCC-potilaiden kasvaimissa. Osoitimme, että 56 %:ssa kasvaimista villityypin alleeli inaktivoidaan heterotsygotian häviämisen avulla. Emme löytäneet vahvistusta hiljattain esitetylle teorialle, jonka mukaan heterotsygotian häviäminen voisi kohdistua mutanttialleeliin. NOD2-geenissä olevat variaatiot 3020insC, R702W and G908R altistavat Crohnin taudille. Olemme aiemmin osoittaneet, että variaatio 3020insC ei lisää riskiä sairastua paksusuolisyöpään suomalaisessa populaatiossa. Tässä työssä genotyyppasimme variaatiot R702W ja G908R 1042 syöpätapauksen ja 508 terveen väestökontrollien aineistossa. Havaitsimme, että suomalaisilla NOD2-geenin variaatioiden kantajilla ei ole kohonnutta syöpäriskiä. Kromosomissa 8q24 sijaitseva yhden nukleotidin variaatio (Single nucleotide polymorphism, SNP) rs6983267 on ensimmäinen koko genomin kattavien assosiaatioanalyysien tuloksena löytynyt paksusuolisyöpäalttiutta lisäävä SNP. Tutkimme tämän yleisen variaation vaikutusta paksusuolisyöpäriskiin suomalaisessa populaatiossa. Osoitimme, että homotsygooteilla G alleelin kantajilla on noin 1,5 kertaa suurempi syöpäriski kuin T alleelin omaavilla henkilöillä. Selvitimme myös riskialleelin G merkitystä kasvaimen kehityksessä ja havaitsimme, että kasvaimissa riskialleelin sisältävä kromosomi on useammin monistunut kuin villityypin alleelin sisältävä kromosomi. Tutkimme variaation rs6983267 roolia geenien säätelyssä käyttäen hyväksi geenien säätelyelementtejä ennustavaa tietokoneohjelmaa, Enhancer Element Locator (EEL). EEL:n ennustuksen mukaan rs6983267 sijaitsee konservoituneessa säätelyelementissa, jossa se muuttaa Wnt signaloinnissa toimivan transkriptiofaktorin TCF4 sitoutumispaikan. Havaitsimme in vitro ja in vivo kokein, että riskialleeli G lisää TCF4 sitoutumista, joka puolestaan johtaa kohdegeenin lisääntyneeseen ekspressioon. Näytimme myös, että SNP:in sisältävä säätelyelementti toimii kudosspesifisessä kohdegeenin säätelyssä. Tuloksemme osoittavat, että paksusuolisyövälle altistava SNP rs6983267 lisää Wnt signalointia solussa.