Development of regulatory T cells in the human thymus

The role of the immune system is to protect an organism against pathogens while maintaining tolerance against self. T cells are an essential component of the immune system and they develop in the thymus. The AIRE (autoimmune regulator) gene product plays an important role in T cell development, as it promotes expression of peripheral tissue antigens in the thymus. Developing T cells, thymocytes, which recognize self-antigens with high affinity are deleted. However, this deletion process is not perfect and not all autoreactive T cells are destroyed. When the distinction between self and non-self fails, tolerance breaks and the immune system attacks the host s own tissues. This results in autoimmunity. Regulatory T cells contribute to the maintenance of self-tolerance. They can actively suppress the function of autoreactive cells. Several populations of cells with regulatory properties have been described, but the best characterized population is the natural regulatory T cells (Treg cells), which develop in the thymus and express the transcription factor FOXP3. The thymic development of Treg cells in humans is the subject of this thesis. Thymocytes at different developmental stages were analyzed using flow cytometry. The CD4-CD8- double-negative (DN) thymocytes are the earliest T cell precursors in the T cell lineage. My results show that the Treg cell marker FOXP3 is up-regulated already in a subset of these DN thymocytes. FOXP3+ cells were also found among the more mature CD4+CD8+ double-positive (DP) cells and among the CD4+ and CD8+ single-positive (SP) thymocytes. The different developmental stages of the FOXP3+ thymocytes were isolated and their gene expression examined by quantitative PCR. T cell receptor (TCR) repertoire analysis was used to compare these different thymocyte populations. My data show that in humans commitment to the Treg cell lineage is an early event and suggest that the development of Treg cells follows a linear developmental pathway, FOXP3+ DN precursors evolving through the DP stage to become mature CD4+ Treg cells. Most T cells have only one kind of TCR on their cell surface, but a small fraction of cells expresses two different TCRs. My results show that the expression of two different TCRs is enriched among Treg cells. Furthermore, both receptors were capable of transmitting signals when bound by a ligand. By extrapolating flow cytometric data, it was estimated that the majority of peripheral blood Treg cells are indeed dual-specific. The high frequency of dual-specific cells among human Treg cells suggests that dual-specificity has a role in directing these cells to the Treg cell lineage. It is known that both genetic predisposition and environmental factors influence the development of autoimmunity. It is also known that the dysfunction or absence of Treg cells leads to the development of autoimmune manifestations. APECED (autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy) is a rare monogenic autoimmune disease, caused by mutations in the AIRE gene. In the absence of AIRE gene product, deletion of self-specific T cells is presumably disturbed and autoreactive T cells escape to the periphery. I examined whether Treg cells are also affected in APECED. I found that the frequency of FOXP3+ Treg cells and the level of FOXP3 expression were significantly lower in APECED patients than in controls. Additionally, when studied in cell cultures, the suppressive capacity of the patients' Treg cells was impaired. Additionally, repertoire analysis showed that the TCR repertoire of Treg cells was altered. These results suggest that AIRE contributes to the development of Treg cells in humans and the selection of Treg cells is impaired in APECED patients. In conclusion, my thesis elucidates the developmental pathway of Treg cells in humans. The differentiation of Tregs begins early during thymic development and both the cells dual-specificity and AIRE probably affect the final commitment of Treg cells.

Immuunijärjestelmä suojaa kehoa hyökkäämällä tunnistamiaan taudinaiheuttajia vastaan. Immuunipuolustuksessa keskeiset T-solut kehittyvät kateenkorvassa. Kehityksen aikana sellaiset solut, jotka tunnistavat omia antigeenejä liian voimakkaasti tuhotaan. Tätä kutsutaan immunologiseksi toleranssiksi. Virheellisten, autoreaktiivisten T-solujen poistamista tehostaa AIRE-geeni (autoimmune regulator). Autoreaktiivisia soluja saattaa kuitenkin päästä elimistöön, jolloin ne voivat aiheuttaa autoimmuunitauteja. T-solujen toimintaa omaa elimistöä vastaan voivat estää säätelijä- eli regulatoriset T-solut (Treg-solut). Tämä väitöskirjatutkimus selvittää Treg-solujen kehitystä ihmisessä. Useita säätelijäsolupopulaatioita on kuvattu, mutta parhaiten tunnetaan FOXP3-transkriptiotekijää ilmentävät Treg-solut. Analysoin varhaisia T-solujen esiasteita eli tymosyyttejä eri kehitysvaiheissa virtaussytometriaa käyttäen. Varhaisin T-solulinjan solu on CD4-CD8- (DN, double-negative) solu. Jo osa näistä varhaisista DN-soluista ilmentää FOXP3-geeniä. FOXP3+ soluja oli nähtävissä myös kypsemmissä tymosyyteissä. Eristin eri kehitysvaiheissa olevia tymosyyttejä ja tutkin eri geenien ekspressiota kvantitatiivisen PCR:n avulla. Lisäksi tarkastelin tymosyyttipopulaatioita vertailemalla niiden T-solureseptorirepertuaareja. Tulokseni viittaavat siihen, että ihmisen Treg-solut eriytyvät omalle kehityslinjalleen jo hyvin varhaisessa vaiheessa ja kehitys etenee samaan tapaan kuin tavallisillakin T-soluilla. Valtaosalla T-soluista on pinnallaan vain yhdenlaisia T-solureseptoreja. Tutkiessani FOXP3+ tymosyyttejä, Treg-solujen esiasteiden geeniekspressio viittasi siihen, että niillä saattaisi olla muita soluja useammin kaksi eri T-solureseptoria pinnallaan. Lisätutkimukset osoittivat havainnon pitävän paikkaansa. Molemmat T-solureseptorit pystyivät myös välittämään signaaleja solun sisään, kun T-solureseptoria stimuloitiin. Virtaussytometriatulosten perusteella arvioimme, että valtaosa verenkierrossa olevista Treg-soluista ekspressoi pinnallaan kahta erilaista T-solureseptoria. Koska solujen määrä on näin suuri, vaikuttaa tämä ominaisuus todennäköisesti Treg-solujen kehitykseen kateenkorvassa. Autoimmuunitautien syntymekanismeja ei tunneta tarkasti, mutta tiedetään, että sekä ympäristötekijöillä että geenivirheillä on vaikutusta. Lisäksi on todettu, että regulatoristen T-solujen toiminnan poikkeavuudet ovat ainakin osatekijä useissa autoimmuunisairauksissa. APECED (Autoimmuunipolyendokrinopatia-kandidiaasi-ektodermaalinen dystrofia) on autoimmuunisairaus, jonka tiedetään olevan harvinainen yhden geenin mutaation aiheuttama tauti. Mutaatio on paikallistettu AIRE-geeniin. Mutaation seurauksena autoreaktiivisten T-solujen tuhoaminen todennäköisesti häiriintyy. Koska Treg-solut ovat tärkeitä immunologisen toleranssin säilyttämisessä, tässä väitöskirjatutkimuksessa tutkittiin myös niiden toimintaa autoimmuunitaudissa, APECEDissa. APECED-potilaiden Treg-solujen analysointi osoitti, että potilailla on huomattavasti vähemmän FOXP3+ -Treg soluja ja näissä soluissa FOXP3-ekspression määrä on matalampi kuin verrokeissa. Lisäksi soluviljelmät osoittivat, että APECED-potilaiden Treg-solujen kyky estää muiden solujen jakaantumista oli heikentynyt. T-solureseptorirepertuaarianalyysi osoitti myös, että APECED-potilaiden Treg-solujen T-solureseptorit eroavat verrokkien Treg-solujen T-solureseptoreista. Tulokset osoittavat, että AIRE:n puuttuessa Treg solujen kehitys on häiriintynyt APECED-potilailla. Väitöskirjatutkimukseni tulokset antavat uutta tietoa Treg-solujen kehityksestä ihmisen kateenkorvassa. Treg-solujen erilaistuminen alkaa hyvin varhaisessa vaiheessa, ja AIRE-geeni sekä kahden eri T-solureseptorin pintaekspressio vaikuttavat niiden kehitykseen.