Identification of two novel human neuronal ceroid lipofuscinosis genes

The neuronal ceroid lipofuscinoses (NCLs) are a group of mostly autosomal recessively inherited neurodegenerative disorders. The aim of this thesis was to characterize the molecular genetic bases of these, previously genetically undetermined, NCL forms. Congenital NCL is the most aggressive form of NCLs. Previously, a mutation in the cathepsin D (CTSD) gene was shown to cause congenital NCL in sheep. Based on the close resemblance of the phenotypes between congenital NCLs in sheep and human, CTSD was considered as a potential candidate gene in humans as well. When screened for mutations by sequencing, a homozygous nucleotide duplication creating a premature stop codon was identified in CTSD in one family with congenital NCL. While in vitro the overexpressed truncated mutant protein was stable although inactive, the absence of CTSD staining in brain tissue samples of patients indicated degradation of the mutant CTSD in vivo. A lack of CTSD staining was detected also in another, unrelated family with congenital NCL. These results imply that CTSD deficiency underlies congenital NCL. While initially Turkish vLINCL was considered a distinct genetic entity (CLN7), mutations in the CLN8 gene were later reported to account for the disease in a subset of Turkish patients with vLINCL. To further dissect the genetic basis of the disease, all known NCL genes were screened for homozygosity by haplotype analysis of microsatellite markers and/or sequenced in 13 mainly consanguineous, Turkish vLINCL families. Two novel, family-specific homozygous mutations were identified in the CLN6 gene. In the remaining families, all known NCL loci were excluded. To identify novel gene(s) underlying vLINCL, a genomewide single nucleotide polymorphism scan, homozygosity mapping, and positional candidate gene sequencing were performed in ten of these families. On chromosome 4q28.1-q28.2, a novel major facilitator superfamily domain containing 8 (MFSD8) gene with six family-specific homozygous mutations in vLINCL patients was identified. MFSD8 transcript was shown to be ubiquitously expressed with a complex pattern of alternative splicing. Our results suggest that MFSD8 is a novel lysosomal integral membrane protein which, as a member of the major facilitator superfamily, is predicted to function as a transporter. Identification of MFSD8 emphasizes the genetic heterogeneity of Turkish vLINCL. In families where no MFSD8 mutations were detected, additional NCL-causing genes remain to be identified. The identification of CTSD and MFSD8 increases the number of known human NCL-causing genes to eight, and is an important step towards the complete understanding of the genetic spectrum underlying NCLs. In addition, it is a starting point for dissecting the molecular mechanisms behind the associated NCLs and contributes to the challenging task of understanding the molecular pathology underlying the group of NCL disorders.

Neuronaaliset seroidilipofuskinoosit (NCL-taudit) ovat ryhmä pääasiassa peittyvästi periytyviä, keskushermostoa rappeuttavia sairauksia. Niiden oireisiin kuuluvat yleensä epilepsiakohtaukset, henkinen ja motorinen taantuminen, näön heikkeneminen sekä ennenaikainen kuolema. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli luonnehtia kahden, aiemmin geneettisesti määrittelemättömän NCL-muodon molekyyligeneettistä taustaa. NCL-taudeista vakavin on synnynnäinen NCL. Tauti havaitaan vastasyntyneillä, ja se johtaa potilaiden kuolemaan muutaman päivän tai viikon kuluessa. Lampaalla vastaavan taudin on todettu johtuvan katepsiini D (CTSD) -geenin mutaatiosta, joten tutkimme geenin osuutta taudin syntyyn myös ihmisellä. Tunnistimme homotsygoottisen, ennenaikaisen lopetuskodonin syntymiseen johtavan mutaation CTSD-geenissä pakistanilaisella perheellä. Osoitimme soluviljelmässä ylituotetun, virheellisen proteiinin olevan vailla entsyymiaktiivisuutta. Potilaiden aivonäytteistä proteiini puuttui kokonaan, mikä viittasi virheellisen geenituotteen hajottamiseen. Tunnistimme CTSD-puutoksen myös toisella perheellä. Nämä tulokset osoittavat CTSD-puutoksen olevan synnynnäisen NCL-taudin taustalla. Turkkilaisessa väestössä esiintyvän myöhäisen lapsuusiän NCL-muodon (vLINCL) ajateltiin alun perin olevan oma geneettinen tautikokonaisuutensa (CLN7). Osalla turkkilaisista vLINCL-potilaista taudin on kuitenkin todettu johtuvan CLN8-geenin virheistä. Tutkimme kaikkien tunnettujen NCL-geenien osuutta taudin syntyyn 13 vLINCL-perheessä. Tunnistimme kaksi uutta, perhekohtaista homotsygoottista mutaatiota CLN6-geenissä. Muissa perheissä kaikki tunnetut NCL-geenit pystyttiin poissulkemaan sairauden taustalta. Löytääksemme näiden perheiden sairauden taustalla olevan geenin, jatkoimme tutkimusta genominlaajuisen kartoituksen avulla. Tunnistimme aiemmin tuntemattomassa major facilitator superfamily domain containing 8 (MFSD8) -geenissä homotsygoottiset mutaatiot kuudella perheellä. Tutkimuksemme osoittavat, että major facilitator superfamily perheeseen kuuluva MFSD8 on todennäköisimmin 12 kertaa kalvon läpäisevä lysosomiin paikantuva kuljettajaproteiini, jonka tarkempaa toimintaa ei vielä tunneta. Perheillä, joilla MFSD8-geenissä ei havaittu mutaatioita, sairauden taustalla on vielä tunnistamattomia geenejä. CTSD- ja MFSD8-geenien tunnistaminen kasvattaa ihmisen tunnettujen NCL-geenien määrän kahdeksaan, mikä on tärkeä askel kohti NCL-tautien geneettisen taustan parempaa tuntemusta. Tutkimustulos mahdollistaa molekyyligenettisen diagnostiikan ja sikiödiagnostiikan perheissä, joissa näitä tauteja esiintyy. Lisäksi se luo perustan näiden NCL-muotojen tautimekanismien tutkimukselle ja edistää koko NCL-tautiryhmän molekyylipatologian ymmärtämystä.