Orphan nuclear receptor subfamily NR4A their interplay with other nuclear receptors and functions in osteoblasts

Nurr1, NGFI-B and Nor1 (NR4A2, NR4A1 and NR4A3, respectively) belong to the NR4A subfamily of nuclear receptors. The NR4A receptors are orphan nuclear receptors which means that activating or repressing ligands for these receptors have not been found. NR4A expression is rapidly induced in response to various stimuli including growth factors and the parathyroid hormone (PTH). The studies concerning the NR4A receptors in the central nervous system have demonstrated that they have a major role in the development and function of the dopaminergic neurons of the midbrain and in regulating hypothalamus-pituitary-adrenal-axis. However, the peripheral functions of the NR4A family are largely unknown. Cultured mouse primary osteoblasts, a preosteoblastic cell line and several osteoblastic cell lines were used to investigate the role of NR4A receptors in osteoblasts. NR4A receptors were shown to directly bind to and activate the promoter of the osteopontin gene (OPN) in osteoblastic cells, thus regulating its expression. OPN is a major bone matrix protein expressed throughout the differentiation of preosteoblastic cells into osteoblasts. The activation of the OPN promoter was shown to be dependent on the activation function-1 located in the N-terminal part of Nurr1 and to occur in both monomeric and RXR heterodimeric forms of NR4A receptors. Furthermore, PTH was shown to upregulate OPN expression through the NR4A family. It was also demonstrated that the fibroblast growth factor-8b (FGF-8b) induces the expression of NR4A receptors in osteoblasts as immediate early genes. This induction involved phosphatidylinositol-3 kinase, protein kinase C, and mitogen activated protein kinase, which are all major pathways of FGF signalling. Nurr1 and NGFI-B were shown to induce the proliferation of preosteoblastic cells and to reduce their apoptosis. FGF-8b was shown to stimulate the proliferation of osteoblastic cells through the NR4A receptors. These results suggest that NR4A receptors have a role both in the differentiation of osteoblasts and in the proliferation and apoptosis of preosteoblast. The NR4A receptors were found to bind to the same response element on OPN as the members of the NR3B family of orphan receptors do. Mutual repression was observed between the NR4A receptors and the NR3B receptors. This repression was shown to be dependent on the DNA-binding domains of both receptor families, but to result neither from the competition of DNA binding nor from the competition for coactivators. As the repression was dependent on the relative expression levels of the NR4As and NR3Bs, it seems likely that the ratio of the receptors mediates their activity on their response elements. Rapid induction of the NR4As in response to various stimuli and differential expression of the NR3Bs can effectively control the gene activation by the NR4A receptors. NR4A receptors can bind DNA as monomers, and Nurr1 and NGFI-B can form permissive heterodimers with the retinoid X receptor (RXR). Permissive heterodimers can be activated with RXR agonists, unlike non-permissive heterodimers, which are formed by RXR and retinoic acid receptor or thyroid hormone receptor (RAR and TR, respectively). Non-permissive heterodimers can only be activated by the agonists of the heterodimerizing partner. The mechanisms behind differential response to RXR agonists have remained unresolved. As there are no activating or repressing ligands for the NR4A receptors, it would be important to find out, how they are regulated. Permissiviness of Nurr1/RXR heterodimers was linked to the N-terminal part of Nurr1 ligand-binding domain. This region has previously been shown to mediate the interaction between NRs and corepressors. Non-permissive RAR and TR, permissive Nurr1 and NGFI-B, and RXR were overexpressed with corepressors silencing mediator for retinoic acid and thyroid hormone receptors (SMRT), and with nuclear receptor corepressor in several cell lines. Nurr1 and NGFI-B were found to be repressed by SMRT. The interaction of RXR heterodimers with corepressors was weak in permissive heterodimers and much stronger in non-permissive heterodimers. Non-permissive heterodimers also released corepressors only in response to the agonist of the heterodimeric partner of RXR. In the permissive Nurr1/RXR heterodimer, however, SMRT was released following the treatment with RXR agonists. Corepressor release in response to ligands was found to differentiate permissive heterodimers from non-permissive ones. Corepressors were thus connected to the regulation of NR4A functions. In summary, the studies presented here linked the NR4A family of orphan nuclear receptors to the regulation of osteoblasts. Nurr1 and NGFI-B were found to control the proliferation and apoptosis of preosteoblasts. The studies also demonstrated that cross-talk with the NR3B receptors controls the activity of these orphan receptors. The results clarified the mechanism of permissiviness of RXR-heterodimers. New information was obtained on the regulation and functions of NR4A receptors, for which the ligands are unknown.

Nurr1, NGFI-B ja Nor1 (NR4A2, NR4A1 ja NR4A3) muodostavat tumareseptoriperheen NR4A. Nämä reseptorit ovat orpoja tumareseptoreja, mikä tarkoittaa sitä, että niiden aktiivisuutta sääteleviä ligandeja (esim. hormoneja, lääkeaineita) ei ole löydetty. Ei siis tiedetä, mikä niiden toimintaa lisää tai vähentää. NR4A-perheen reseptoreilla on todettu tärkeä rooli keskiaivojen dopamiinisolujen kehittymisessä ja toiminnassa sekä aivolisäke-käpylisäke-lisämunuaisakselin hormonierityksessä. Hermoston ulkopuolella NR4A-perheen reseptorien toimintaa ei ole juurikaan tutkittu. Tutkimuksessa selvitettiin NR4A-perheen toimintaa luukudoksessa käyttämällä osteoblastiviljelmiä. Osteoblastit ovat luuta tuottavia soluja. NR4A-reseptorien todettiin NR4A-perheen välittävän luun muodostusta lisäävän lisäkilpirauhashormonin vaikutuksia osteoblasteissa. NR4A-perheen reseptorit sitoutuvat osteopontiinigeenin (OPN) säätelyalueelle ja lisäävät osteopontiinin muodostusta solussa. Osteopontiini on tärkeä luuväliaineen proteiini. Lisäkilpirauhashormonin todettiin säätelevän osteopontiinin tuotantoa osittain NR4A-perheen kautta. Tutkimukset osoittivat myös fibroblastin kasvutekijän 8b lisäävän NR4A-perheen reseptorien tuotantoa soluissa. Nurr1 ja NGFI-B lisäsivät osteoblastien jakautumista sekä vähensivät solujen kuolemista. Nor1 ei vaikuttanut soluihin. Tulosten perusteella voidaan päätellä NR4A-perheen reseptoreiden vaikuttavan monipuolisesti luuta muodostavien solujen säätelyyn ja toimintaan. Tutkimuksessa todettiin NR4A-reseptorien säätelevän OPN-geenin säätelyaluetta yhteistyössä NR3B-perheen orpojen tumareseptorien kanssa. NR3B-perheen reseptorit vähensivät NR4A-perheen reseptorien aiheuttamaa aktiivisuutta ja päinvastoin. Suoritetuissa kokeissa vähentyneeseen aktiivisuuteen vaikutti lähinnä NR4A-perheen reseptorien määrä suhteessa NR3B-perheen reseptoreihin. Nurr1 ja NGFI-B voivat sitoutua geenien säätelyalueille paitsi yksinään, myös yhdessä, dimeereinä, retinoidi X:n reseptorin (RXR) kanssa. Nämä dimeerit voidaan aktivoida RXR:n ligandilla, toisin kuin monien muiden tumareseptorien RXR:n kanssa muodostamat dimeerit. Tutkimuksessa tämä ominaisuus, permissiivisyys, liitettiin Nurr1-proteiinin tiettyyn osaan, jonka tiedetään osallistuvan aktiivisuutta vähentävien korepressorien sidontaan. Tulosten perusteella permissiivisiä dimeerejä muodostavat NGFI-B ja Nurr1 sitovat korepressoreja paljon heikommin kuin ei-permissiivisiä dimeerejä muodostavat tumareseptorit. Korepressorien irtoaminen RXR:n ligandien vaikutuksesta havaittiin mekanismiksi, joka erottaa permissiiviset RXR-dimeerit ei-permissiivisistä. Väitöskirjatyössä saadut tulokset valottavat NR4A-perheen toimintaa ja toiminnan säätelyä keskushermoston ulkopuolisissa kudoksissa. NR4A-perheen aktiivisuutta mahdollisesti säädellään elimistössä yhteistyössä NR3B-perheen reseptorien kanssa. Myös permissiivisten dimeerien muodostumisella RXR:n kanssa lienee tärkeä rooli. NR4A-perheellä on oletettavasti tärkeä rooli osteoblastien lisääntymisessä ja kuolemassa sekä luun proteiinien tuotannossa. Lisäksi on merkittävää, että Nurr1 ja NGFI-B säätelevät solujen kasvua toisin kuin läheinen sukulainen Nor1. Tulevissa tutkimuksissa on NR4A-perheen reseptorien osuutta luun muodostumisessa ja sen häiriöissä selvitettävä edelleen. Lisäksi on tutkittava, voivatko NR4A-perheen reseptorit säädellä myös muiden solujen, erityisesti kasvainsolujen, jakautumista ja kuolemaa.