The Mechanisms of Hedgehog Signal Transduction

Studies in both vertebrates and invertebrates have identified proteins of the Hedgehog (Hh) family of secreted signaling molecules as key organizers of tissue patterning. Initially discovered in Drosophila in 1992, Hh family members have been discovered in animals with body plans as diverse as those of mammals, insects and echinoderms. In humans three related Hh genes have been identified: Sonic, Indian and Desert hedgehog (Shh, Ihh and Dhh). Transduction of the Hh signal to the cytoplasm utilizes an unusual mechanism involving consecutive repressive interactions between Hh and its receptor components, Patched (Ptc) and Smoothened (Smo). Several cytoplasmic proteins involved in Hh signal transduction are known in Drosophila, but mammalian homologs are known only for the Cubitus interruptus (Ci) transcription factor (GLI(1-3)) and for the Ci/GLI-associated protein, Suppressor of Fused (Su(fu)). In this study I analyzed the mechanisms of how the Hh receptor Ptc regulates the signal transducer Smo, and how Smo relays the Shh signal from the cell surface to the cytoplasm ultimately leading to the activation of GLI transcription factors. In Drosophila, the kinesin-like protein Costal2 (Cos2) is required for suppression of Hh target gene expression in the absence of ligand, and loss of Cos2 causes embryonic lethality. Cos2 acts by bridging Smo to the Ci. Another protein, Su(Fu) exerts a weak suppressive influence on Ci activity and loss of Su(Fu) causes subtle changes in Drosophila wing pattern. This study revealed that domains in Smo that are critical for Cos2 binding in Drosophila are dispensable for mammalian Smo function. Furthermore, by analyzing the function of Su(Fu) and the closest mouse homologs of Cos2 by protein overexpression and RNA interference I found that inhibition of the Hh response pathway in the absence of ligand does not require Cos2 activity, but instead critically depends on the activity of Su(Fu). These results indicate that a major change in the mechanism of action of a conserved signaling pathway occurred during evolution, probably through phenotypic drift made possible by the existence in some species of two parallel pathways acting between the Hh receptor and the Ci/GLI transcription factors. In a second approach to unravel Hh signaling we cloned > 90% of all human full-length protein kinase cDNAs and constructed the corresponding kinase-activity deficient mutants. Using this kinome resource as a screening tool, two kinases, MAP3K10 and DYRK2 were found to regulate Shh signaling. DYRK2 directly phosphorylated and induced the proteasome dependent degradation of the key Hh-pathway regulated transcription factor, GLI2. MAP3K10, in turn, affected GLI2 indirectly by modulating the activity of DYRK2.

Hedgehog (Hh) -perheen kasvutekijät säätelevät alkion kehitystä ja kudosten erilaistumista niin selkärankaisissa kuin selkärangattomissakin eläinlajeissa. Hhkasvutekijää koodaava geeni löydettiin vuonna 1992 banaanikärpäsestä (Drosophila melanogaster), jonka jälkeen tämän geeniperheen geenejä on löydetty useista muistakin eliölajeista –hyönteisistä nisäkkäisiin. Ihmisellä Hh geenejä on kolme: Sonic (Shh), Indian (Ihh) ja Desert (Dhh). Hedgehog kasvutekijän signaalinvälitykselle ovat tyypillisiä useat molekyylien väliset estävät vuorovaikutukset. Hh kasvutekijän sitoutuminen reseptoriproteiini Patchediin (Ptc) estää Ptc:n toiminnan ja vapauttaa signaalinvälittäjäproteiini Smoothenedin (Smo) Ptc:n estävästä vaikutuksesta. Useat Hh signaalinvälitykseen osallistuvat molekyylit on alunperin löydetty banaanikärpäsestä, ja nisäkkäiden Hh signaalinvälitykseen osallistuvista sytoplasmisista komponenteista on tunnistettu vain transkriptiotekijä Cubitus interruptusta (Ci) vastaavat GLI(1-3), ja Ci/GLI proteiineja sitova Suppressor of Fused (Su(Fu)). Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää kuinka Shh-signaali välittyy solun pinnalta solun sisään johtaen lopulta GLI transkriptiotekijöiden aktivoitumiseen ja signaalinvälitysreitin kohdegeenien ilmentymiseen. Banaanikärpäsessä kinesiinin-kaltainen proteiini Costal2 (Cos2) säätelee keskeisesti signaalinvälitysreitin toimintaa ja Cos2 geenin puute johtaa kärpäsessä toukan kehityksen häiriintymiseen ja kuolemaan. Myös toinen proteiini, Su(Fu) osallistuu Ci-transkriptiotekijän aktiivisuuden hienosäätöön banaanikärpäsessä, mutta sen puutos aiheuttaa vain hyvin pieniä muutoksia siiven rakenteessa. Tutkimuksessamme havaitsimme yllättäen, että Hh-signaalinvälitysreitin toiminta eroaa merkittävästi nisäkkäiden ja kärpäsen välillä, alkaen heti solun pinnalla olevan Smo proteiinin rakenteesta. Eristettyämme Cos2 geenin nisäkäshomologit huomasimme myös, ettei niiden toimintaa tarvita nisäkkäissä. Nisäkkäissä signaalireitin aktiivisuutta sääteleekin keskeisesti Su(Fu). Tuloksemme osoittavat, että muuttumattomina pidetyt signaalinvälitysreitit voivat muuttua evoluution aikana. Löytääksemme uusia nisäkkäiden Hh-signaalinvälitysreitin toimintaa sääteleviä geenejä, eristimme myös yli 90% kaikista ihmisen proteiinikinaaseista ja analysoimme niiden merkitystä Shhsignaalireitin toiminnalle tehoseulontamenetelmin. Näin pystyimme löytämään kaksi uutta Shh-signaalireitin toimintaa säätelevää proteiinikinaasia, MAP3K10 ja DYRK2. Havaitsimme, että DYRK2 vaikuttaa suoraan GLI-transkriptiotekijöihin fosforyloimalla niitä ja johtaen näin niiden hajotukseen. MAP3K10 puolestaan vaikuttaa GLItranskriptiotekijöihin epäsuorasti, säätelemällä muiden kinaasien, mm. DYRK2:n, toimintaa.