Biophysical Characterization of Oxidized Phospholipids : Implications for Altered Membrane Structure and Function

The present study aims to elucidate the modifications in the structure and functionality of the phospholipid matrix of biological membranes brought about by free radical-mediated oxidative damage of its molecular constituents. To this end, the surface properties of two oxidatively modified phospholipids bearing an aldehyde or carboxyl function at the end of truncated sn-2 acyl chain were studied using a Langmuir balance. The results obtained reveal both oxidized species to have a significant impact on the structural dynamics of phospholipid monolayers, as illustrated by the progressive changes in force-area isotherms with increasing mole fraction of the oxidized lipid component. Moreover, surface potential measurements revealed considerable modifications in the electric properties of oxidized phospholipid containing monolayers during film compression, suggesting a packing state-controlled reorientation of the intramolecular electric dipoles of the lipid headgroups and acyl chains. Based on the above findings, a model describing the conformational state of oxidized phospholipid molecules in biological membranes is proposed, involving the protrusion of the acyl chains bearing the polar functional groups out from the hydrocarbon phase to the surrounding aqueous medium. Oxidative modifications alter profoundly the physicochemical properties of unsaturated phospholipids and are therefore readily anticipated to have important implications for their interactions with membrane-associating molecules. Along these lines, the carboxyl group bearing lipid was observed to bind avidly the peripheral membrane protein cytochrome c. The binding was reversed following increase in ionic strength or addition of polyanionic ATP, thus suggesting it to be driven by electrostatic interactions between cationic residues of the protein and the deprotonated lipid carboxyl exposed to the aqueous phase. The presence of aldehyde function bearing oxidized phospholipid was observed to enhance the intercalation of four antimicrobial peptides into phospholipid monolayers and liposomal bilayers. Partitioning of the peptides to monolayers was markedly attenuated by the aldehyde scavenger methoxyamine, revealing it to be mediated by the carbonyl moiety possibly through efficient hydrogen bonding or, alternatively, formation of covalent adduct in form of a Schiff base between the lipid aldehydes and primary amine groups of the peptide molecules. Lastly, both oxidized phospholipid species were observed to bind with high affinity three small membrane-partitioning therapeutic agents, viz. chlorpromazine, haloperidol, and doxorubicin. In conclusion, the results of studies conducted using biomimetic model systems support the notion that oxidative damage influences the molecular architecture as well as the bulk physicochemical properties of phospholipid membranes. Further, common polar functional groups carried by phospholipids subjected to oxidation were observed to act as molecular binding sites at the lipid-water interface. It is thus plausible that oxidized phospholipid species may elicit cellular level effects by modulating integration of various membrane-embedded and surface-associated proteins and peptides, whose conformational state, oligomerization, and functionality is known to be controlled by highly specific lipid-protein interactions and proper physical state of the membrane environment.

Solujen kalvorakenteet koostuvat lipidi- ja proteiinimolekyyleistä sekä osaan näistä kovalenttisesti kiinnittyneistä hiilihydraattiosista. Kalvot reunustavat solulimaa sekä solun sisäisiä organelleja ja ylläpitävät näiden kemiallista koostumusta säätelemällä molekyylien kulkeutumista sisä- ja ulkopuolisten nestetilojen välillä. Lisäksi ne toimivat erityyppisten soluviestintään osallistuvien molekyylien kohteina ja varastoina sekä tarjoavat alustan useille keskeisille biokemiallisille prosesseille. Kalvojen rakenteellinen runko muodostuu seoksesta amfipaattisia fosfolipidimolekyylejä, jotka organisoituvat vesiliuoksissa spontaanisti kaksoiskerrokseksi. Fosfolipidien tiedetään jakaantuvan muodostamissaan kalvoissa koostumukseltaan erilaistuneisiin alueisiin, ja on osoitettu, että tämä heterogeeninen järjestäytyminen on vahvasti kytkeytynyt kalvorakenteiden toiminnallisiin ominaisuuksiin. Valtaosa aitotumallisten solujen kalvojen sadoista erityyppisistä fosfolipideistä kantaa tyydyttymättömiä rasvahappoketjuja. Nämä ovat alttiita solumetabolian sivutuotteina syntyvien reaktiivisten happiyhdisteiden välittämille hapetusreaktioille, joissa ketjut lyhenevät ja niihin muodostuu erityyppisiä polaarisia funktionaalisia ryhmiä. Tämän tutkimuksen päämääränä oli kartoittaa hapettuneiden fosfolipidien ominaisuuksia biofysikaalisia metodeja ja biomimeettisiä mallikalvosysteemejä hyödyntäen sekä selvittää hapetusreaktioiden mukanaan tuomia muutoksia biologisten kalvojen rakenteessa ja toiminnassa. Tutkittaessa kahden hapettuneen fosfolipidin käyttäytymistä veden ja ilman väliselle rajapinnalle muodostetuissa ns. Langmuir-kalvoissa havaittiin, että molekyylien aldehydi- tai karboksyyliryhmän sisältävillä hapettuneilla rasvahappoketjuilla on taipumus siirtyä kalvon hydrofobisesta ytimestä ympäröivään vesifaasiin, mahdollistaen ketjujen toimimisen kiinnittymiskohtina kalvorakenteisiin assosioituville molekyyleille. Pintakemiallisia ja fluoresenssispektroskooppisia tekniikoita hyödyntäen saadut tulokset osoittivat, että karboksyyliryhmää kantava lipidi sitoo voimakkaasti periferaalista kalvoproteiini sytokromi c:tä elektrostaattisten interaktioiden seurauksena. Lisäksi havaittiin, että tällä fosfolipidillä on jopa 100-kertainen affiniteetti eräisiin amfipaattisiin lääkeaineisiin (klooripromatsiini, haloperidoli ja doksorubisiini) ei-hapettuneisiin molekyyleihin verrattuna. Aldehydiryhmän sisältämä hapettunut fosfolipidi puolestaan lisäsi merkittävästi neljän antimikrobiaalisen peptidin sitoutumista Langmuir-kalvoihin sekä kalvovesikkeleihin. Väitöskirjatyön tulokset valottavat sitä, kuinka biologisten kalvojen fosfolipidimolekyylien hapettuminen voi johtaa muutoksiin kalvorakenteiden fysikokemiallisissa ominaisuuksissa, joilla nykytiedon valossa on keskeinen merkitys kalvoproteiinien lokalisaation, kolmiulotteisen rakenteen sekä aktiivisuuden säätelyssä. Hapettuneiden fosfolipidien lisääntynyt muodostus on yhdistetty solujen ikääntymiseen sekä eräiden kertymäsairauksien, kuten Alzheimerin taudin ja ateroskleroosin patogeneesiin, joskin taustalla vaikuttavat molekyylitason mekanismit tunnetaan toistaiseksi huonosti. Esitettyjen tulosten perusteella voidaan olettaa, että molekyylien lisääntyneestä hapettumisesta seuraavat muutokset fosfolipidimatriisin kemiallisessa koostumuksessa heijastuvat kokonaisvaltaisesti kalvorakenteiden pinnoilla tapahtuviin fysiologisiin prosesseihin ja saattavat siten olla yhteydessä näiden sekä koko solun toiminnan häiriöihin.