Expression of functional GABAc receptors in the brain

γ-aminobutyric acid (GABA) is the main inhibitory transmitter in the nervous system and acts via three distinct receptor classes: A, B, and C. GABAC receptors are ionotropic receptors comprising ρ subunits. In this work, we aimed to elucidate the expression of ρ subunits in the postnatal brain, the characteristics of ρ2 homo-oligomeric receptors, and the function of GABAC receptors in the hippocampus. In situ hybridization on rat brain slices showed ρ2 mRNA expression from the newborn in the superficial grey layer of the superior colliculus, from the first postnatal week in the hippocampal CA1 region and the pretectal nucleus of the optic tract, and in the adult dorsal lateral geniculate nucleus. Quantitative RT-PCR revealed expression of all three ρ subunits in the hippocampus and superior colliculus from the first postnatal day. In the hippocampus, ρ2 mRNA expression clearly dominated over ρ1 and ρ3. GABAC receptor protein expression was confirmed in the adult hippocampus, superior colliculus, and dorsal lateral geniculate nucleus by immunohistochemistry. From the selective distribution of ρ subunits, GABAC receptors may be hypothesized to be specifically involved in aspects of visual image motion processing in the rat brain. Although previous data had indicated a much higher expression level for ρ2 subunit transcripts than for ρ1 or ρ3 in the brain, previous work done on Xenopus oocytes had suggested that rat ρ2 subunits do not form functional homo-oligomeric GABAC receptors but need ρ1 or ρ3 subunits to form hetero-oligomers. Our results demonstrated, for the first time, that HEK 293 cells transfected with ρ2 cDNA displayed currents in whole-cell patch-clamp recordings. Homomeric rat ρ2 receptors had a decreased sensitivity to, but a high affinity for picrotoxin and a marked sensitivity to the GABAC receptor agonist CACA. Our results suggest that ρ2 subunits may contribute to brain function, also in areas not expressing other ρ subunits. Using extracellular electrophysiological recordings, we aimed to study the effects of the GABAC receptor agonists and antagonists on responses of the hippocampal neurons to electrical stimulation. Activation of GABAC receptors with CACA suppressed postsynaptic excitability and the GABAC receptor antagonist TPMPA inhibited the effects of CACA. Next, we aimed to display the activation of the GABAC receptors by synaptically released GABA using intracellular recordings. GABA-mediated long-lasting depolarizing responses evoked by high-frequency stimulation were prolonged by TPMPA. For weaker stimulation, the effect of TPMPA was enhanced after GABA uptake was inhibited. Our data demonstrate that GABAC receptors can be activated by endogenous synaptic transmitter release following strong stimulation or under conditions of reduced GABA uptake. The lack of GABAC receptor activation by less intensive stimulation under control conditions suggests that these receptors are extrasynaptic and activated via spillover of synaptically released GABA. Taken together with the restricted expression pattern of GABAC receptors in the brain and their distinctive pharmacological and biophysical properties, our findings supporting extrasynaptic localization of these receptors raise interesting possibilities for novel pharmacological therapies in the treatment of, for example, epilepsy and sleep disorders.

Gamma-aminovoihappo (GABA) on keskushermoston tärkein ehkäisevä välittäjäaine. GABA-reseptorit jaetaan rakenteen ja farmakologisten ominaisuuksien perusteella kolmeen ryhmään. GABAA- ja GABAC-reseptorit ovat ionotrooppisia kloridikanavareseptoreita, kun taas GABAB-reseptorit ovat metabotrooppisia. Ionotrooppiset GABA-reseptorit koostuvat viidestä alayksiköstä, joita tunnetaan GABAC-reseptoreille kolme erilaista: ρ1, ρ2 ja ρ3. Väitöskirjatyön tarkoituksena oli selvittää GABAC-reseptoreiden ilmentymistä ja toimintaa keskushermostossa, erityisesti hippokampuksessa. Ensimmäisessä osatyössä GABAC-reseptoreiden ρ-alayksikköjä löytyi varhaisemmassa yksilönkehityksen vaiheessa ja useammalta keskushermoston alueelta kuin aiemmin oli havaittu. In situ -hybridisaatiomenetelmällä havaittiin ρ2-alayksikön lähetti-RNA:ta verkkokalvon, hippokampuksen, ylemmän nelikukkulalevyn ja muiden näköjärjestelmän tumakkeiden lisäksi myös näköaivokuorelta kolmesta eri kerroksesta. Kvantitatiivisella RT-PCR-menetelmällä todettiin kaikkien kolmen alayksikön lähetti-RNA:ta hippokampuksesta jo vastasyntyneeltä. Immunosytokemiallisilla vasta-ainevärjäyksillä voitiin vahvistaa, että ρ-proteiinia löytyi kaikilta niiltä aivoalueilta, joilla oli todettu ρ2-alayksikön mRNA:ta. Toisessa osatyössä pystyttiin ensimmäistä kertaa ekspressoimaan toimivia rotan ρ2-alayksikön muodostamia homomeerisiä reseptoreita HEK-293-soluissa. Ne olivat herkempiä sekä GABAlle että pelkästään GABAC-reseptoreihin vaikuttavalle CACAlle kuin ρ1ρ2-heteromeerit, mutta huomattavan epäherkkiä pikrotoksiinille, joka pystyi suurillakin pitoisuuksilla aiheuttamaan vain osittaisen antagonismin. Toisaalta kuitenkin tällä homomeerillä oli hyvin korkea-affiininen pikrotoksiinin sitoutumiskohta. Kolmannessa osatyössä voitiin osoittaa, että hippokampuksen CA1-alueen pyramidaalisoluissa on toimivia GABAC-reseptoreita. Niiden aktivaatio hyvin pienellä, toisen osatyön perusteella ρ2-alayksikköspesifisellä CACA-pitoisuudella pienensi hermosoluryhmän vasteita. Hyvin voimakas stimulaatiosarja aktivoi sekä GABAA- että GABAC-reseptorit CA1-alueella ja saadaan kaksiosainen vaste, joka koostuu tavanomaisesta hyperpolarisaatiosta ja pitkäkestoisesta depolarisaatiosta. GABAC-reseptoriantagonisti TPMPA sai aikaan oleellisia muutoksia erityisesti depolarisaatiovaiheen kestossa. Samantyyppinen vaste TPMPA:lle saatiin myös ilman erittäin voimakasta stimulaatiota silloin, kun välittäjäaineen poisto synapsiraosta oli estetty ja GABAa diffundoitui enemmän synapsiraon ulkopuolelle. Tulokset tukevat hypoteesia, että hippokampuksen GABAC-reseptorit saattavat olla ekstrasynaptisia eli sijaita välittömästi synapsin ulkopuolella ja aktivoitua silloin, kun välittäjäainetta läikkyy yli synapsiraosta. Ekstrasynaptisia GABAA-reseptoreja on aiemmin löydetty useilta alueilta, myös hippokampuksesta. GABAC-reseptorit ja nämä δ-alayksikön sisältävät ekstrasynaptiset GABAA-reseptorit muistuttavat toisiaan erityisesti herkkyydessään GABAlle ja desensitisoitumattomuudessaan. Väitöskirjatyön perusteella voidaan yhteenvetona olettaa, että GABAC-reseptorit osallistuvat liikkuvan kuvan prosessointiin aivoissa ja että hippokampuksen GABAC-reseptorit ovat ekstrasynaptisia ja optimoivat hippokampuksen tietojenkäsittelykapasiteettia läikkymisinhibition avulla. Hippokampuksessa GABAC-reseptoreiden aktivaatio pystyi hillitsemään epileptistyyppisiä, patologisen voimakkaita neuronipopulaation vasteita, jotka GABAA-reseptorien estäminen bikukulliinilla oli saanut aikaan. Kun lisäksi huomioidaan GABAC-reseptoreiden sijainti vain osassa keskushermostoa ja niiden erityinen farmakologia ja kinetiikka, väitöskirjatyön löydökset voivat tulevaisuudessa olla tärkeitä kehitettäessä uusia lääkkeitä toisaalta epilepsiaan, toisaalta unihäiriöihin, erityisesti narkolepsiaan ja unettomuuteen.